白方腐乳中產胺細菌分離鑒定及產胺性能檢測

蘇澤,譚貴良,劉子雄,黃嘉曼,李梅,胡文鋒*

1(華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)2(電子科技大學 中山學院,廣東 中山,528402)3(中山市食品藥品檢測所,廣東 中山,528437)

腐乳是極具中國特色的大豆發酵食品之一,至今已有1 500年的悠久歷史[1]。腐乳滋味鮮美、風味獨特,廣受消費者喜愛。腐乳按照色澤風味可分為白腐乳、紅腐乳、青(臭)腐乳3大類[2]。腐乳的生產環節分為前發酵和后發酵2個階段。前發酵是通過自然接種或人工接種,培養富含蛋白酶的微生物;后發酵則是腐乳裝瓶后酶與微生物協同作用[3],后發酵階段既是風味物質[4-5]產生的主要階段,也是有害物質生成的主要階段[6-7]。

生物胺(biogenic amines,BAs)是一類廣泛存在于食品中的低分子質量含氮有機化合物的總稱,常見的有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺以及亞精胺。雖然人體攝入微量的生物胺能促進生長、增強代謝活力、增強免疫力和清除自由基等效用,但過量攝入生物胺則會引起頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應[8]。腐乳因富含蛋白質、氨基酸,容易累積生物胺。LI等[9]檢測了64種來自15個不同產地腐乳樣品中的生物胺,所有樣品均檢測出腐胺、酪胺、苯乙胺、色胺以及尸胺等常見生物胺,其中白腐乳總生物胺含量高達533.54 mg/kg。根據SANTOS等[10-11]對生物胺的推薦毒性限量(苯乙胺30 mg/kg、組胺100 mg/kg、酪胺100～800 mg/kg),目前從商品腐乳中檢測出的苯乙胺(736.64 mg/kg)[12]、組胺(1 186.93 mg/kg)[13]、酪胺(1 730 mg/kg)[14]含量均嚴重超過推薦毒性限量。本課題組前期對不同商品腐乳的研究也發現不同地區腐乳總生物胺含量差異很大(53.59～5 837.10 mg/kg)[15],8個樣品中有5個都超過生物胺推薦最高污染水平1 000 mg/kg[10]。這些結果表明,腐乳中生物胺含量過高已影響腐乳成品質量及食品安全性問題[16]。

生物胺的產生離不開微生物對氨基酸的脫羧反應,以及適合這些微生物合成氨基酸脫羧酶并發揮其作用的理化條件。前期對腐乳產生物胺菌的研究主要集中在微生物群落水平,例如LIANG等[17]研究發現紅方腐乳發酵菌群結構的變化會影響生物胺的生成,枯草芽孢桿菌和熱帶芽孢桿菌會在腐乳后發酵7～28 d時增加組胺、酪胺、腐胺和尸胺的生成量。本課題組基于宏基因組鳥槍測序對我國市場上不同類型商品腐乳中產生物胺的微生物群落及重建物種進行了研究,發現重建物種含有不同種類的脫羧酶基因和豐度[15]。

最近,陸續有從商品腐乳中分離鑒定出產胺菌的報道。梁靜靜等[18]從24種市售腐乳樣品中分離出20株產胺菌,經過16S rDNA鑒定后均為芽孢桿菌屬。王維亞等[19]從12種不同品牌的江西腐乳中獲取到6株產胺菌(耐熱芽孢桿菌、魯梅利桿菌、耐硼賴氨酸芽孢桿菌和皮脂葡萄球菌),經檢測發現這些菌產腐胺和酪胺的量最大。但至今未見從腐乳后發酵環節中分離出產胺菌的報道。

基于此,本研究以廣東典型白方腐乳后發酵過程樣品為研究對象,對產胺菌進行分離、純化和鑒定,并對典型菌株的產胺特性進行研究。目的是了解腐乳生產過程中的產胺菌種類和不同條件對產胺菌產胺特性的影響,為控制生物胺的產生提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 樣品

白方腐乳后發酵樣品,廣東省江門市恩平縣的一家傳統腐乳生產廠。

1.1.2 試劑

LB肉湯培養基:蛋白胨1%,酵母浸出粉0.5%,胰蛋白胨1%(均為質量分數)。

產生物胺篩選培養基(g/L):牛肉浸出粉5.0,酵母浸出粉5.0,胰蛋白胨5.0,葡萄糖0.5;吐溫-80 1 mL;NaCl 2.5,FeSO40.04,MnSO40.05,MgSO40.2,K2HPO42,CaCO30.1,檸檬酸銨2,維生素B10.01,5-磷酸吡哆醛0.05,溴甲酚紫0.06,瓊脂18。色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸各5,調節pH至5.3;121 ℃滅菌15 min[20]。

標準品:組氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、磷酸吡哆醛(均為分析純),美國Sigma公司;組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺(純度≥98%),上海阿拉丁試劑有限公司;丹磺酰氯(純度≥98%),分析純,上海安譜實驗科技股份有限公司。

DNA提取試劑盒,湖南艾科瑞生物工程有限公司;引物:27F/1492R,TD2/TD5,上海生工生物工程股份有限公司;dNTPs、TaqDNA聚合酶,TaKaRa;Sepharose 6B瓊脂糖,北京索萊寶科技有限公司;核酸染液、DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA,北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司;乙酸,天津永大化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器設備

FA 2004B電子分析天平,上海佑科儀器儀表有限公司;HCB-900V超凈工作臺,青島海爾生物醫療股份有限公司;DSX-24L-I高壓滅菌鍋,上海申安醫療器械廠;LRH-150F生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;PB-10酸度計,賽多維斯科學儀器(北京)有限公司;BX53生物顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司;ST 8R高速冷凍離心機、MAXQ 4000臺式恒溫冷凍搖床、2720 thermal cycler PCR儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜系統,蘇州市萊頓科學儀器有限公司;DYY-6C電泳儀,北京六一生物科技有限公司;BIO-RAD GelDoc GO凝膠成像系統,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;VICTOR Nivo酶標儀,珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產胺菌的分離純化及形態觀察

稱取25 g腐乳樣品,在無菌條件下將腐乳溶于225 mL無菌生理鹽水,使用無菌玻璃棒進行研磨,攪拌均質,得到10-1濃度的稀釋液。分別從10-1的稀釋液中吸取1 mL,按10-2、10-3、10-4和10-5濃度稀釋后,再從每個濃度稀釋液中吸取100 μL涂布于產生物胺篩選培養基平板上,于37 ℃倒置培養24 h,觀察平板顏色變化。挑選不同稀釋梯度平板上單個紫色菌落,用生理鹽水按10-3、10-4和10-5梯度稀釋后得到稀釋菌液,再分別從每個梯度的稀釋菌液中吸取100 μL涂布于產生物胺篩選培養基平板上,于37 ℃倒置培養24 h,觀察平板顏色變化。按上述純化過程重復2～3次,得到單菌落。對分離菌株用LB肉湯培養基富集后,取單菌液進行革蘭氏染色后于顯微鏡下進行形態學觀察。

1.2.2 產胺菌的分子生物學鑒定

DNA提取:按照SteadyPure細菌基因組DNA提取試劑盒說明進行提取。

PCR擴增:采用16S rDNA序列通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進行擴增。PCR擴增體系:45 μL 1×TSE 101 mix、引物27F和引物1492R各2.0 μL(10 μm)、1.0 μL 模板DNA。PCR擴增條件:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,56 ℃復性10 s,72 ℃延伸10 s/kb,共35個循環;72 ℃再延伸5 min;最后于4 ℃保存。

結果檢測:將擴增好的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送樣至深圳市易科吉生物科技有限公司進行測序,以鑒定產胺菌株種屬。

1.2.3 超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法分析離菌株發酵液中的生物胺

將上述步驟純化得到的菌株接種于LB肉湯培養基中富集培養8～10 h(對數期),取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,添加質量分數0.005%的磷酸吡哆醛和質量分數0.1%的氨基酸(組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和賴氨酸),130 r/min搖床培養2 d,取1 mL發酵液于UPLC分析,平行測定3次。

生物胺含量的測定采用柱前衍生化法。樣品前處理方法參考李大偉等[21]的方法稍加修改。取1 mL上述步驟的培養液于15 mL離心管中,加入400 μL 1 mol/L NaOH溶液,然后加入300 μL的緩沖飽和溶液NaHCO3,再加入1 mL提前溶于丙酮的質量濃度10 mg/mL的丹磺酰氯溶液,渦旋1 min,然后在避光條件下42 ℃水浴45 min,取出后加入100 μL氨水終止反應,再于黑暗中靜置30 min,最后用乙腈定容至5 mL。10 000 r/min離心5 min,吸取1～1.5 mL的衍生化溶液過0.22 μm的有機濾膜打入樣品瓶,用于UPLC檢測分析。色譜條件參考HU等[15]的方法。

1.2.4 不同環境因素對產酪胺菌生長研究

取70 μL處于對數期菌懸液接種于7 mL LB肉湯培養基(添加質量分數為0.005%的磷酸吡哆醛和質量分數為0.1%氨基酸,下同)中。37 ℃培養2 d,每12 h取樣,除不同pH值環境因素外,其余所有培養基的pH值均控制在5.50。不同環境因素水平:溫度15、25、35 ℃;乙醇體積分數0、5%、10%、15%、20%、25%;氨基酸質量分數0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;pH值4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5;NaCl質量分數0、3.0%、6.0%、9.0%。每組設置空白對照,分別取樣200 μL測定發酵液的OD600nm。

1.2.5 不同環境因素對產酪胺菌產胺特性研究

溫度的影響:取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,分別于15、25、35 ℃,130 r/min搖床培養2 d,取1 mL培養液用于UPLC分析,并設空白對照。

氨基酸質量分數的影響:取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,分別添加質量分數為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的氨基酸,37 ℃、130 r/min搖床培養2 d,取1 mL培養液用于UPLC分析,并設空白對照。

NaCl質量分數的影響:取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,分別添加質量分數為0、3.0%、6.0%和9.0%的NaCl,37 ℃、130 r/min搖床培養2 d,取1 mL培養液用于UPLC分析,并設空白對照。

乙醇體積分數的影響:取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,分別按體積分數0、5%、10%、15%、20%、25%添加乙醇,37 ℃、 130 r/min搖床培養2 d,取1 mL培養液用于UPLC分析,并設空白對照。

pH值的影響:取1 mL處于對數期菌懸液接種于100 mL LB肉湯培養基中,調節pH值依次為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.5,37 ℃、130 r/min搖床培養2 d,取1 mL培養液用于UPLC分析,并設空白對照。

1.2.6 數據分析

實驗平行測定3次,實驗結果表示為平均值±標準偏差。所有數據圖表采用Excel 2016和GraphPad Prism 8軟件進行制作分析。

2 結果與分析

2.1 產胺菌的篩選及形態學觀察

添加溴甲酚紫的產生物胺篩選培養基是一種檢測氨基酸脫羧酶陽性微生物的平板篩選方法[22]。產生物胺篩選培養基加入了多種氨基酸和顯色劑溴甲酚紫,當微生物利用氨基酸合成堿性的生物胺時,會使培養基菌落周圍pH上升從而顯紫色。因此挑選培養基菌落周圍紫色的菌株進行分離和純化。

分離和純化后,從發酵后期45 d的白腐乳樣品中初步篩選出8株產生物胺菌,菌株編號S1～S8(表1)。對這些菌進行革蘭氏染色和細胞形態觀察,發現除了S5為革蘭氏陽性球菌,其余菌株均為革蘭氏陽性桿菌。

表1 菌株的形態學鑒定Table 1 Morphological identification of strains

由圖1-a可知,S5菌落中心為白色,菌落較小,呈顆粒狀,邊緣平滑整齊且有紫色物質生成。結合革蘭氏染色結果及形態(圖1-b)可以初步判斷此菌為革蘭氏陽性球菌。但是也應該看到,溴甲酚紫的顯色反應只能指示微生物生長環境的pH升高[23],并不能完全證實該菌就是產胺菌,因此還需要對初篩的菌株作進一步驗證。

a-平板菌落形態;b-光學顯微鏡圖圖1 菌株S5的形態學特征Fig.1 Morphological characteristics of strain S5

將8個菌株提取DNA及PCR擴增后,進行測序、比對分析。結果顯示,S1、S2、S3、S8等4株為擬蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)、S4為熱帶芽孢桿菌(Bacillustropicus)、S5為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、S6為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、S7為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(表2)。除菌株S1與參考序列相似性較低外(94.49%),其他7個菌株與比對的參考物種的相似性均大于99.7%。

表2 16S rDNA序列 Blast 比對Table 2 Blast analysis of 16S rDNA sequences

2.2 菌株培養液中的生物胺含量

2.2.1 生物胺回歸方程和混合標準品溶液的色譜圖

由圖2可知,標準品中的8種生物胺和內標在25 min內得到較好分離,各生物胺單標的回歸方程及相關系數如表3所示,其線性回歸方程相關系數R2均大于0.997,生物胺含量和峰面積之間呈良好的線性相關,說明結果可信。

圖2 生物胺混合標準溶液的UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of biogenic amines BAs standards

表3 生物胺的保留時間、回歸方程和相關系數Table 3 Retention time, the regression equations and correlation coefficients of biogenic amines

2.2.2 產胺菌的產胺情況

由表4可知,分離和純化出的8株產胺菌都產腐胺、尸胺和酪胺,腐胺生成量在0.68～5.81 mg/L;尸胺生成量在0.53～9.33 mg/L;酪胺生成量在0.45～87.31 mg/L。其中,S1產色胺,S1、S3和S5產亞精胺,所有菌株均不產組胺。梁靜靜等[18]報道了分離自商品紅腐乳中5種產胺菌(枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、熱帶芽孢桿菌)的酪胺生成量在11.56～18.22 mg/L,腐胺生產量在11.56～18.22 mg/L。本研究發現S5(屎腸球菌)產生物胺總量最高,高達106.34 mg/L。該菌主要產酪胺和苯乙胺,含量分別占產生物胺總量的82.10%和12.68%。值得注意的是,只有該菌產苯乙胺,含量為13.48 mg/L。菌株S5的生物胺檢測色譜圖見圖3。

圖3 產胺菌S5中生物胺的UPLC色譜圖Fig.3 UPLC chromatogram of biogenic amines in strains S5

表4 八株產胺菌中生物胺含量 單位:mg/LTable 4 Contents of biogenic amines in eight biogenic amine producing strains

此外,屎腸球菌也從火腿、奶酪中分離得到,被證明具有產酪胺的能力[24-25]。JEONG等[26]從醬曲中分離的屎腸球菌在給與前體物質氨基酸的培養條件下,能產生高達3 397.4 mg/L的酪胺,未產生組胺,這與本研究S5的產胺結果相似。綜上,菌株S5產不同種生物胺的含量存在很大差異,除溫度、NaCl濃度、pH值等環境因素影響外,還可能與其編碼不同氨基酸脫羧酶的基因有關[15]。

2.2.3 不同環境因素對屎腸球菌S5生長與產胺特性的影響

2.2.3.1 不同環境因素對屎腸球菌S5生長的影響

選取產生物胺水平最高的S5為研究對象,測定不同環境因素對其生長活性的影響。結果表明,35 ℃的環境對S5的生長最有利,而15 ℃低溫則會抑制S5的生長(圖4-a)。當環境中的乙醇體積分數<15%時,S5能正常生長,但隨著乙醇體積分數升高,對S5的抑制作用越強(圖4-b)。S5在質量分數為0～0.5%的氨基酸中吸光度值變化趨勢相近,表明此濃度范圍的氨基酸對該菌生長不產生明顯影響(圖4-c)。而過高(pH>8.5)和過低(pH<5.5)的pH環境都不利于S5的生長(圖4-d)。當NaCl質量分數為6.0%時,可對S5的生長產生一些抑制,當NaCl質量分數為9.0%時,該菌的生長明顯受到抑制(圖4-e)。

a-溫度;b-乙醇體積分數;c-氨基酸質量分數;d-pH值;e-NaCl質量分數(下圖同)圖4 不同環境因素對屎腸球菌S5生長的影響Fig.4 Effect of different environmental factors on Enterococcus faecium S5 growth

2.2.3.2 溫度對屎腸球菌S5產胺特性的影響

當培養溫度15 ℃時,S5的酪胺生成量很低,為11.44 μg/mL。但隨著溫度持續升高,總胺生成量也持續增加,35 ℃時達到最高值77.78 μg/mL(圖5-a)。這可能是由于S5在15 ℃低溫環境下48 h的生長明顯低于35 ℃下48 h的生長(圖4-a),導致15 ℃時S5產胺水平降低。

2.2.3.3 乙醇對屎腸球菌S5產胺特性的影響

從圖5-b可知,乙醇體積分數在0～15%時,S5總胺含量從119.52 μg/mL增加到123.39 μg/mL,可能是低濃度的乙醇能提升S5氨基酸脫羧酶的活力,王俊朋等[27]認為少量的酒精對酶活力有促進作用。但是,當添加的乙醇體積分數>15%時,總胺和酪胺含量都呈現下降趨勢。高濃度乙醇抑制生物胺的產生,可能與其抑制了菌體的生長有關,因為S5在乙醇體積分數>15%時生長緩慢(圖4-b)。

2.2.3.4 氨基酸對屎腸球菌S5產胺特性的影響

圖5-c顯示當氨基酸質量分數在0.1%～0.5%時,S5的生物胺含量呈先增加后減少的趨勢,在氨基酸質量分數0.3%時總胺含量達到峰值120.17 μg/mL,當質量分數達到0.5%時總胺含量降低至101.56 μg/mL。本研究結果與梁靜靜等[18]研究的氨基酸質量分數對產胺菌產胺特性的影響趨勢一致。原因可能與脫羧作用的“臨界點”有關,當培養液中的氨基酸質量分數>0.3%后,S5的總胺和酪胺含量不增反減,這反映出氨基酸濃度對S5產胺的有限促進作用[28]。

2.2.3.5 pH對屎腸球菌S5產胺特性的影響

圖5-d顯示出S5合成生物胺的最佳pH在6.5～7.5,峰值pH 6.5的總胺和酪胺含量分別為110.85和105.93 μg/mL。過低或過高的pH會抑制S5氨基酸脫羧酶的活性,減少其產胺量。一定的酸性條件下可以刺激S5酪胺脫羧酶的活性,已有研究證實酸性條件可誘導編碼酪氨酸脫羧酶(tdcA)和編碼酪氨酸-酪胺反轉運蛋白基因(tyrP)影響產胺菌酪胺的表達量[29]。此外,S5在不同pH值條件下的產胺量趨勢,與其在此培養條件下的生長趨勢也基本一致(圖4-d)。

2.2.3.6 NaCl對屎腸球菌S5產胺特性的影響

NaCl質量分數<3.0%對S5的產胺性能影響較小,隨著NaCl質量分數的增大,達到6.0%～9.0%時,S5的產胺量持續下降。當NaCl濃度為9.0%時,S5產總胺和酪胺量最低,分別為75.88、70.12 μg/mL(圖5-e)。高NaCl濃度主要通過高濃度的Na+抑制S5酪氨酸脫羧酶活性[30-31],從而影響生物胺的形成。

3 結論

本研究首次從白方腐乳后發酵環節中分離純化出8株產胺菌,經16S rDNA序列鑒定,4株為擬蕈狀芽孢桿菌,其余4株分別為熱帶芽孢桿菌、屎腸球菌、解淀粉芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌。通過超高效液相色譜技術對這8株產胺菌的產胺特性進行定性定量分析,結果發現菌株S5(屎腸球菌)產胺能力較強(106.34 mg/L),酪胺產生量高達87.31 mg/L。對菌株S5不同環境因素中的生長特性和產胺能力進行系統研究,發現不同的環境因素(如溫度、氨基酸、NaCl、乙醇和pH值)對該菌生長活性和產胺能力有很大影響。在溫度<15 ℃、乙醇體積分數>15%、氨基酸質量分數<0.5%、pH>7.5、NaCl質量分數>6.0%條件下,S5產胺量降低,進一步提示腐乳生產過程中可以通過對上述環境條件的調節來控制生物胺的產生。