乳酸菌混合發酵在紅棗漿中的發酵特性研究

陳曉維,溫靖,肖更生,徐玉娟,吳繼軍,余元善,鄒波,李璐,卜智斌

(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所,農業農村部功能食品重點實驗室,廣東省農產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510610)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科棗屬植物果實,原產于亞洲和南歐[1]。紅棗果實成熟后變為紅色,呈橢圓形,略有光澤,有不規則褶皺,果質松軟,果味甘甜,被列為“五果”(桃、梅、李、棗、杏)之一,素有“木本糧食”之稱[2]。紅棗富含蛋白質、氨基酸、維生素以及礦物質等多種營養成分。此外,紅棗中還存在許多化學成分,包括多糖、類黃酮、皂苷和環狀核苷酸等,這些化學成分已被證明具有多種生物活性,如抗炎、抗癌、抗氧化、對造血功能和大腦神經有益并且具有調節腸道菌群作用等[3-4]。我國是全球主要的紅棗生產國,產量占全球90%以上[5]。

乳酸菌具有調節腸道菌群、增強人體免疫力、降低血清膽固醇等多種功能[6]。國內外研究學者利用干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等常見的乳酸菌對單一或復合果蔬汁進行發酵,均取得了較好的效果[7-10]。發酵紅棗漿作為紅棗的一種加工產品,風味獨特,棗香濃郁,保留了紅棗中的多酚、有機酸、多糖等功能成分,符合消費者追求天然、健康的食品趨勢,具有一定的市場效益與發展潛力。目前,發酵紅棗漿的報道主要集中在不同乳酸菌的單株發酵特性、乳酸菌發酵工藝優化、乳酸菌復合酵母菌發酵酒醋工藝等方面[10-12]。關于乳酸菌混合發酵紅棗漿的報道還比較少[13],且尚未見關于對不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿的營養功能成分(多酚、黃酮、多糖、抗壞血酸和有機酸等)和抗氧化活性變化的相關報道。

本文以紅棗漿為原料,通過添加3種不同益生菌(干酪乳桿菌和植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的復合菌進行混合發酵,旨在為開發新型功能性乳酸菌發酵紅棗漿提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗(去核),新疆西圣果業有限公司;干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,本實驗室保藏;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、抗壞血酸、沒食子酸、蘆丁,上海源葉生物有限公司;MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)肉湯、MRS瓊脂培養基,廣東環凱有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

WF-A2000型榨汁機,美的集團公司;RP-101折光儀,日本愛宕有限公司;PB-10型pH計,德國Sartorius公司;SPX-250B-Z生化培養箱,上海博訊實業有限公司;SW-CJ-2FD無菌操作臺,蘇州安康空氣技術有限公司;Biofuge Stratos Sorvall高速冷凍離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;UV1800紫外分光光度計,日本島津公司;UltraScan VIS 全自動色差儀,美國HunterLab公司;HWS電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅棗漿的制備

挑選無霉變的去核紅棗,料水比1∶3(g∶mL)加入純凈水,在蒸籠中蒸煮20 min后用打漿機打漿,獲得的紅棗漿分裝到玻璃瓶中,將分裝好的紅棗漿放入水浴鍋中進行滅菌處理(90 ℃,5 min)。殺菌后貯藏于-20 ℃冷庫中備用。

1.3.2 乳酸菌培養物制備

從-80 ℃冰箱中取出保藏的3種乳酸菌(干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的甘油管,在超凈工作臺中進行MRS固體培養基中劃線,將劃線的MRS固體培養基置于培養箱中,37 ℃培養48 h,挑取各乳酸菌的菌落分別接種于MRS液體培養基,置于振蕩培養箱于37 ℃、150 r/min培養12 h至菌液吸光度(OD)為4。

1.3.3 紅棗漿的乳酸菌發酵培養

紅棗漿解凍后,置于超凈工作臺上,分別在已滅菌的250 mL三角瓶中加入100 g紅棗漿,每瓶分別接入干酪乳桿菌+植物乳桿菌、植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌+植物乳桿菌的乳酸菌培養物(接種量為紅棗漿質量的1%),置于37 ℃的振蕩培養箱中振蕩培養,每8 h取樣1次,測定其菌落總數;并根據繪制的微生物生長曲線確定發酵終點,測定發酵前后的理化指標。

1.3.4 乳酸菌活菌數的測定

參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》采用稀釋倒平板法測定乳酸菌菌落總數。

1.3.5 pH和可滴定酸的測定

pH值使用pH計直接測定。可滴定酸的測定按照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》,采用pH計電位滴定法進行測定,總酸度以乳酸計。

1.3.6 紅棗漿色差的測定

采用色差儀測定紅棗漿樣品發酵前后的色澤(L、a和b值表示),結果用總色差ΔE表示,按公式(1)計算:

(1)

式中:L0、a0、b0表示未發酵紅棗漿的色澤參數;L、a、b表示發酵紅棗漿的色澤參數。

1.3.7 總酚含量的測定

采用福林酚法測定[14],結果以沒食子酸當量表示。

1.3.8 總黃酮的測定

參照WU等[15]的方法,稍作修改。總黃酮含量用蘆丁表示。

1.3.9 多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法測定[16],結果以葡萄糖表示。

1.3.10 有機酸和抗壞血酸的測定

參考WU等[15]的方法,采用高效液相色譜進行測定。抗壞血酸檢測波長為254 nm,有機酸檢測波長210 nm,并采用外標法定量。

1.3.11 DPPH自由基清除力的測定

參照ZOU等[17]的方法并略作修改,樣品清除DPPH自由基的能力以1 g樣品清除Trolox的質量相當,以mg/g表示。

1.3.12 ABTS陽離子自由基清除力的測定

1.4 統計分析

所有的不同處理均重復3次,數據結果采用SPSS 23.0進行方差分析,數值以平均值±標準差表示,并用Origin 8.5.1軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌混合發酵期間紅棗漿中乳酸菌數量的變化

從圖1可知,在發酵0～24 h,乳酸菌活菌數呈對數增長,發酵24 h后進入穩定的生長期,3種復合乳酸菌的活菌數均可達到9.4 lg CFU/mL以上。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌復合發酵的紅棗漿中活菌數高于其余2組,這可能是由于不同乳酸菌種的差異所致。在發酵24 h后,3種復合乳酸菌在紅棗漿中的活菌數均呈下降趨勢,這是由于紅棗漿中的碳源隨發酵時間的延長被消耗以及乳酸菌發酵產酸引起的環境變化,抑制了乳酸菌的生長[19]。綜上,紅棗漿營養豐富,3種復合乳酸菌均能在紅棗漿中較好的生長繁殖。為了使發酵紅棗漿中含有較高的益生菌活菌數,選擇發酵24 h為發酵終點,分析比較了不同乳酸菌混合發酵前后(發酵0 h和發酵24 h)對紅棗漿的理化指標、營養功能成分和抗氧化活性的影響。

2.2 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿pH和可滴定酸的變化

由圖2可知,紅棗漿的最初pH值約為4.79。在發酵24 h后,3種混合乳酸菌發酵的紅棗漿中的 pH 值均呈下降趨勢,這主要是由于在發酵過程中產生了醋酸和乳酸等代謝物。其中,干酪乳桿菌和植物乳桿菌發酵的紅棗漿的pH最大,而植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵的紅棗漿的 pH 值最小。經發酵24 h,紅棗漿pH值顯著降低,從而抑制乳酸菌菌株的生長和繁殖,導致乳酸菌的生長能力下降,與上述2.1節乳酸菌生長曲線中發酵24 h后活菌數下降的趨勢一致。這些結果與之前對植物乳桿菌發酵的紅棗汁的研究結果一致[19]。

a-pH;b-可滴定酸圖2 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿pH和可滴定酸的變化Fig.2 Changes in pH and titratable acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

從圖2可知,紅棗漿的初始可滴定酸含量為4.29 mg/g。發酵24 h后,3種混合乳酸菌發酵紅棗漿所產生的可滴定酸均呈現出上升趨勢。3種乳酸菌混合發酵的紅棗漿在發酵后可滴定酸含量均達到6.7 mg/g(以乳酸計)左右,產酸能力較為明顯,其中植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發酵的紅棗漿總可滴定酸含量最高,但3組無顯著性差異。

2.3 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿色差的變化

由圖3可知,發酵24 h后,不同乳酸菌混合發酵的紅棗漿的色差值大體上均呈增大的趨勢。其中,干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發酵的紅棗漿的色差值最大,為1.22;植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵的紅棗漿的色差值最小,為0.21。環境(發酵時間、發酵溫度)的影響、乳酸菌對紅棗漿的發酵利用以及相關物質的產生,使得發酵后紅棗漿的色澤發生了一定的改變,但具體的變化原因與方式尚未明確,還需進一步的探究[20]。研究顯示,經植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發酵對紅棗漿的色澤影響較小,發酵后紅棗漿的色澤與未發酵的紅棗漿顏色更接近。

圖3 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿色差的變化Fig.3 Changes of jujube pulp color difference after mixed fermentation with different strains

2.4 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿總酚的變化

由圖4可知,在發酵24 h后,3種紅棗漿的總酚含量均呈上升趨勢。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵的紅棗漿的總酚含量最高,為0.62 mg/g,而干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發酵的紅棗漿的總酚含量最低,為0.57 mg/g。王琪[21]報道了經乳酸菌發酵的紅棗汁的總酚濃度高于未發酵紅棗汁。RICCI等[22]對無花果汁進行發酵,發現發酵無花果汁的總酚含量高于未發酵組。發酵后紅棗漿中總酚含量的顯著增加可能是因為發酵使植物細胞釋放出一些可溶性或不可溶性的酚類化合物。

圖4 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿總酚的變化Fig.4 Changes in total phenolics of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.5 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿總黃酮的變化

如圖5所示,在發酵24 h后,3種紅棗漿的總黃酮含量均有所增加。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵的紅棗漿的總黃酮含量最高,相比未發酵組增加了16.28%;而干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發酵的紅棗漿的總黃酮含量最低,增加了6.52%。-DOR-DEVIE等[23]也報道了乳酸菌在發酵過程中會產生葡萄糖苷酶,有可能促進了小麥和玉米秸稈提取物總黃酮含量的增加,與本研究結果一致。

圖5 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿總黃酮的變化Fig.5 Changes in total flavonoids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.6 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿多糖的變化

紅棗多糖是紅棗中最重要的營養功能成分之一,具有抗癌、抗炎、增強免疫力和保護肝臟等多種藥理活性[4]。如圖6所示,發酵24 h后,3種紅棗漿中多糖含量均明顯高于未發酵組。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌復合發酵的紅棗漿中多糖含量最高,與其余2組比較差異不顯著。發酵后紅棗漿多糖含量的增加可能是由于乳酸菌在發酵過程中產生胞外多糖。WANG等[24]研究報道了植物乳桿菌HW47和YW11能夠產生胞外多糖,與本研究結果一致。

圖6 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿多糖的變化Fig.6 Changes in polysaccharides of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.7 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿抗壞血酸和有機酸的變化

從表1可知,紅棗漿中的抗壞血酸含量經發酵后略微下降但無顯著差異,說明乳酸菌發酵對紅棗漿中的抗壞血酸影響較小。

表1 紅棗漿經不同乳酸菌混合發酵后抗壞血酸和有機酸的變化 單位:mg/gTable 1 Changes in ascorbic and organic acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

在發酵果蔬汁中,益生菌能分解糖生成有機酸,同時有機酸也是微生物的重要次生代謝產物[22]。紅棗漿中主要的有機酸分別是檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和乳酸,這與GUO等[25]的研究結果一致。發酵 24 h 后, 干酪乳桿菌+植物乳桿菌、植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌+鼠李糖乳桿菌這3組混合發酵組分別產生了3.69、3.40、3.30 mg/g的乳酸,此外還分別產生了1.26、1.06、1.08 mg/g的乙酸。XU等[8]也報道了隨著乳酸菌的生長,乳酸菌發酵的胡蘿卜、蘋果、橙子和紅棗的復合果蔬汁中乳酸含量增加,這主要與乳酸菌發酵分解糖或轉化檸檬酸和蘋果酸有關。3種不同乳酸菌混合發酵均表現出對檸檬酸有較強的轉化能力,但發酵后不同乳酸菌混合發酵結果無統計學上的差異,紅棗漿的檸檬酸含量降低了84.15%左右。檸檬酸含量的降低可能是因為在發酵早期,乳酸菌將檸檬酸作為碳源被消耗的結果[19]。與檸檬酸的趨勢相似,經乳酸菌混合發酵后,不同發酵組的紅棗漿中蘋果酸含量均呈下降趨勢,其中干酪乳桿菌+植物乳桿菌轉化蘋果酸的能力比其余2組強,但3組無統計學上的差異。發酵后,紅棗漿蘋果酸含量降低可能與自身的蘋果酸經過蘋果酸-乳酸發酵途徑被代謝轉化有關[19],經發酵24 h后,紅棗漿中酒石酸含量有所增加,但與發酵前對比,差異不顯著。草酸經發酵后含量也稍有下降,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌發酵組的紅棗漿草酸含量最低,減少了20%。

2.8 不同乳酸菌混合發酵前后紅棗漿抗氧化活性的變化

由圖7可知,經乳酸菌發酵后,紅棗漿的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基抗氧化能力均有所增強。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵組的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基抗氧化活性值顯著高于其余2組。發酵24 h后,紅棗漿的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基抗氧化活性增強可能與發酵后多酚、黃酮等生物活性成分的增加有關,與余偲等[26]的研究結果一致。以上結果表明,利用乳酸菌混合發酵可以提高紅棗漿中的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除活性;b-ABTS陽離子自由基清除活性圖7 不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿抗氧化活性的變化Fig.7 Changes in antioxidant activity of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

3 結論與討論

紅棗漿營養豐富,3種不同乳酸菌兩兩混合均能在紅棗漿中較好的生長,在發酵24 h后,3個發酵組均進入穩定生長期,活菌數均可達到9.4 lg CFU/mL。在紅棗漿發酵過程中,3種不同乳酸菌混合發酵組均能產酸,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌的產酸能力較強,但與其他2組無顯著差異。不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿色澤存在差異,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵的紅棗漿色澤與未發酵的紅棗漿顏色更接近。而在不同乳酸菌混合發酵24 h后,紅棗漿中的總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化活性均呈上升趨勢,并且不同乳酸菌混合發酵表現的能力差異很大,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌在紅棗漿發酵24 h后對總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化活性優于其余2個發酵組。此外,還對不同乳酸菌混合發酵后紅棗漿抗壞血酸和有機酸的差異進行分析,發酵后紅棗漿中的檸檬酸、蘋果酸和草酸含量降低,乳酸和乙酸含量增加,抗壞血酸和酒石酸含量無明顯變化。綜上,紅棗漿應以植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發酵為宜。