溫度與光照作用下超高溫滅菌牛奶特征風味的變化及評價

李澤鵬，鄧玉明，曾 科，習鴻杰，盧立新,*，宋利君

（1.江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010100）

超高溫滅菌（ultra high-temperature，UHT）牛奶營養成分含量豐富，組分種類繁多，其中脂肪、蛋白質、碳水化合物、VC和核黃素等營養物質，都會受到溫度、光照、氧氣和微生物等影響，發生物理和化學變化，隨著反應程度的加深，會產生異味、營養成分損失和顏色惡化等，其中特征風味是影響牛奶質量的首要因素，進而將影響消費者的健康安全及用奶體驗，特別是溫度和光照共同作用下的UHT牛奶光氧化反應對風味影響尤為關鍵[1-4]。對于UHT牛奶而言，風味變化對產品品質辨別起到關鍵性作用，因此了解并利用UHT牛奶風味對品質控制非常重要[5-8]。

由于牛奶基質的復雜性，在變質反應發生后，風味對于消費者感官評測的影響同樣具有綜合效應，僅憑單一風味無法完全表征、判斷乳品品質。為此，解析UHT牛奶多風味的綜合屬性，定量描述分析牛奶風味差異成為分析品質的主要手段。目前利用風味變化對牛奶品質變化準確表征和預測已有了廣泛應用。Singh等[9]采用多個理化參數與感官評價風味評分搭建聯系，實現對牛奶品質表征。Melanie等[10]通過生存分析研究風味屬性的變化，作為UHT牛奶貨架期結束的預測指標。李娟等[11]采用氣相色譜-離子遷移譜技術分析乳制品中揮發性風味化合物，判別和區分了不同類型和品牌的乳制品。潘明慧等[12]采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用技術評判了國內外牛奶風味物質對于消費者喜愛的影響；陳臣等[13]引入正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）法研究了乳扇感官屬性與風味物質之間的聯系。

不同貯存溫度、光通量和初始不飽和脂肪酸含量作為影響牛奶品質隨時間變化的關鍵因素[14]，綜合影響著牛奶的風味變化。Jiang Yujun等[15]通過對配方奶粉在不同溫度下的揮發性物質研究，鑒定了產品品質變化并預測貨架期；Tan Dongfei等[4]探究光照強度對于牛奶品質和氧化產物的影響；Ajmal等[16]研究了不同初始脂肪酸含量的UHT牛奶在長時間貯存過程中的品質變化。

隨著UHT牛奶廣泛的推廣，新產品、新銷售和貯存環境對牛奶品質變化準確表征和預測提出了新挑戰。本研究應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace-SPME-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）聯用技術檢測多種溫度、光照強度下3 種配方UHT牛奶在貯存過程中揮發性風味成分變化，應用相關性檢驗和熵權法表征牛奶特征風味的綜合作用，開展以貯存溫度、光通量和初始不飽和脂肪酸含量為影響的特征風味和綜合作用預測，為不同環境下貯藏不同配方食品的風味變化預測提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究樣品為最新生產的3 種不同初始不飽和脂肪酸質量濃度的UHT純牛奶，均由伊利集團提供。樣品編號及主要成分見表1。

表1 實驗產品基本信息Table 1 Basic information of test products

正己烷、正壬醛、苯甲醛、2-庚酮、2-辛酮等標準品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（純度≥95.0%）、混合脂肪酸甲酯標準品 上海百靈威化學技術有限公司；十一碳酸甘油三酯（純度99%）上海安譜璀世標準技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

RQH-350人工氣候箱 上海右一儀器有限公司；Pegasus HRT+4D全二維氣相色譜-高分辨飛行時間質譜儀美國力可公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津（香港）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

采用全面設計法，參考國內外研究及牛奶日常使用、貯存條件，實驗條件見表2。

表2 UHT牛奶特征風味變化試驗設計Table 2 Experimental scheme for changes in the characteristic flavor of UHT milk

1.3.2 牛奶中風味物質測定

HS-SPME萃取分離揮發性化合物：選用2-甲基-3-庚酮作為內標物[12]，純水作為溶劑，質量濃度為8.16 mg/L。取預處理的牛奶5 mL及20 μL內標物溶液置于20 mL的頂空樣品瓶中。60 ℃恒溫水浴中加熱平衡30 min，進樣器固定在HS-SPME搭載裝置上，將針頭插入頂空瓶中，推出萃取纖維，頂空吸附萃取30 min。吸附時間結束后，將萃取纖維插入GC-MS進樣口250 ℃解吸3 min。

GC-MS條件：MXF-WAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氣相進樣口溫度250 ℃，初溫40 ℃，保留3 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保留6 min；載氣：高純He（99.999%），流速1.0 mL/min；離子源溫度210 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；電流1 mA；質量掃描范圍m/z33～400；捕獲延遲80 s。

定性和定量分析：應用NIST 2014和Wiley 9譜庫和由正構烷烴（C6～C26）測得的保留指數結合LECO公司軟件設置正反匹配度均大于800（最大值為1000），保留指數偏差30以內進行數據檢索。結合譜庫檢索和保留指數檢索同時作用獲得最終定性結果。定量結果通過2-甲基-3庚酮為內標物的內標法確定。

1.3.3 感官評價

根據ISO 8586標準，來自江南大學訓練有素的15 名小組成員參與評價。大量研究表明氣味和味道屬性很大程度上決定了消費者對牛奶的喜好程度，故設置感官評分總分100 分，氣味、味道和外觀分別占比40%、40%和20%[17]。

采用表3中的牛奶感官評價描述與屬性評估與新鮮牛奶差異性，每個描述詞分別代表最直接的感官屬性，在感官量表上使用1～9 分對UHT牛奶喜好情況進行評估。其中，1 分代表牛奶品質特性令消費者極不滿意，9 分代表品質特性受到消費者高度認可。在感官測試前1 d準備感官評價的樣品，并在5 ℃保存，測試前2 h置于室溫環境。

表3 牛奶感官評價描述與屬性Table 3 Descriptions and attributes of sensory evaluation of milk

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次，采用Origin 2022b學習版軟件繪制實驗數據圖像。使用IBM SPSS Statistics 21軟件、SIMCA 14.1軟件和Excel軟件對樣品數據進行相關性分析和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）分析、熵權法權重分析；通過數據線性擬合處理，建立牛奶風味預測模型，并使用相對誤差（%）和擬合優度（R2）對所建模型進行準確性分析。

式中：Pobs為觀測參數值；Ppred為預測參數值；n為觀測次數。

2 結果與分析

2.1 牛奶感官評價

基于部分感官評價結果繪制的感官評價輪廓圖（圖1）展示了不同配方UHT牛奶新鮮風味和變質風味具有差異性，其中脂肪含量對風味影響顯著。新鮮GM牛奶和UM牛奶各項指標均使消費者滿意；盡管DM牛奶由于脂肪含量偏低，導致顏色偏黃，奶香味不足且寡淡味和蒸煮味顯著，但仍然被消費者高度認可。GM牛奶、UM牛奶和DM牛奶發生嚴重光氧化變質后，均產生了嚴重的油膩味、粉末味、紙板味、苦味且顏色明顯變白，導致其感官評價分值顯著下降，消費者已經不可接受。

圖1 不同配方UHT牛奶樣品的風味輪廓圖Fig.1 Flavor profiles of UHT milk samples with different formulations

選擇有代表性的2 組（298 K、33.35 lm/L和310 K、300.18 lm/L）多個時間試樣進行風味評分和整體總分的相關性分析，結果見表4。油膩味、粉末味、奶香味、紙板味、苦味、寡淡味、甜味和顏色等指標對于3 種不同配方牛奶光氧化引起的品質變化均有較高相關性，蒸煮味僅對UM牛奶和DM牛奶具有顯著相關性，而臭味和澀味影響不顯著。在顯著影響的風味中，寡淡味和甜味與感官評分成負相關趨勢，隨著品質下降，感官評分反而上升。這是由于不同品質牛奶的這2 種風味差異性不大，并且脂肪光氧化過程讓感官評價小組產生了復雜的風味感受導致的。在區分配方差異的基礎上，對試樣進行風味評分和整體總分的相關性分析，其結果與單項分析結果相同，油膩味、粉末味、奶香味、紙板味、寡淡味、甜味和顏色等指標對于3 種不同配方牛奶光氧化引起的品質變化均有顯著相關性，可作為總體評分的主要評價依據。

表4 不同配方UHT牛奶樣品各風味評分與整體評價總分相關性Table 4 Correlation between flavor scores and overall scores of UHT milk samples with different formulations

2.2 風味物質定性和定量分析

2.2.1 精密度、加標回收率和基質效應（matrix effect，ME）

本實驗中2-戊酮、2-壬酮、2-庚酮、2-十一烷酮、2-辛酮、己醛、壬醛、戊醛、苯甲醛、二甲基三硫等測定日內精密度為1.28%～9.42%，日間精密度為6.06%～12.92%，4 個加標濃度下的平均回收率為83.94%～110.44%，表明測試方法有良好的精密度和加標回收率[23]。盡管部分短鏈脂肪酸ME值較大，牛奶基質復雜存在一定影響，但大部分物質ME值在89.43%～121.23%之間，故可忽略ME[24]，并可利用標準曲線進行修正。

2.2.2 風味物質定性與定量分析結果

如圖2所示，確定UHT牛乳中的揮發性風味物質有醛酮類、酸類、酯類、烴類，另外還有二甲醚、二甲硫、苯類等物質。

圖2 不同配方UHT牛奶風味物質總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of flavor compounds in different formulations of UHT milk

經光氧化反應后，牛奶品質變化成消費者不可接受時，GM牛奶、UM牛奶、DM牛奶樣品中醛、酮、醇和酸類物質種類和含量明顯增多，同時伴隨產生硫化物。這些揮發性物質的生成會帶來多種風味的綜合效應繼而影響消費者感官感受，已有多個研究證實其濃度的高低與風味存在一定相關性。如表5所示，揮發性風味物質濃度的差異性與風味差異性基本吻合。

表5 不同配方UHT牛奶中鑒定的部分揮發性風味化合物Table 5 Volatile flavor compounds identified in different formulations of UHT milk

UHT牛奶中部分揮發性風味化合物鑒定結果見圖3。針對牛奶特征風味變化以及對應揮發性風味物質的相關性分析表明，己醛、壬醛、2-辛酮、2-庚酮、苯甲醛等揮發性風味物質變化與牛奶特征風味評價變化規律保持一致，數據分析結果也表明兩者顯著相關（在0.05水平上顯著相關）且相對誤差較小。同時通過OPLS-DA分析2 種品質3 種牛奶的風味物質進行檢驗[13]，驗證不同品質牛奶的風味物質差異性（表6）。統計VIP值大于1的變量，確定己醛、壬醛、2-辛酮、2-庚酮等揮發性風味物質與特征風味變化顯著相關；苯甲醛含量影響2 種感官風味，VIP值接近于1與特征風味變化相關。通過VIP值進一步篩選，特殊風味所對應的揮發性物質屬于牛奶光氧化反應主要產物，一定程度上表征了牛奶品質情況，濃度愈高品質愈惡劣，與國內外研究情況一致[1,2,6,22]。

圖3 不同品質UHT牛奶中鑒定的部分揮發性風味化合物Fig.3 Some volatile flavor compounds identified in fresh and spoiled UHT milk

表6 與特征風味相關的揮發性風味物質Table 6 Volatile flavor compounds significantly associated with characteristic flavors

2.3 風味物質濃度預測

在包裝特性基本一致前提下，相關機理研究[28-29]及本研究表明，貯存溫度、樣品接受光通量、牛奶初始不飽和脂肪酸含量對風味物質生成速率影響顯著。

全面實驗中不同實驗條件的不同配方牛奶，己醛、壬醛等揮發性物質隨時間的變化符合零級反應動力學[8,15]，其t時刻下風味物質質量濃度可表示為：

反應活化能（Ea）表征UHT牛奶從穩定態轉變為容易發生化學反應的活躍狀態所需要能量，Arrhenius方程系數（A0）表征不同配方UHT牛奶反應本性常數[28]。由于牛奶中普遍存在光敏劑，光照將激發光氧化反應進程，賦予變質反應所需能量，不同光照強度對光氧化反應本性和活化能的影響也具有差異性。不飽和脂肪酸作為光氧化主要反應底物，不同產品間其含量差異顯著，也會對光氧化反應本性和活化能造成顯著性差異影響。因此，研究它們與反應本性和活化能之間的關系，可以表征特定條件下的反應速率（表7），貯存溫度、樣品接受光通量、牛奶初始不飽和脂肪酸含量的影響可利用Arrhenius方程表征，即：

表7 揮發性風味物質含量受光通量和初試不飽和脂肪酸的影響Table 7 Effect of light flux and initial unsaturated fatty acid content on volatile flavor compounds of UHT milk

2.4 綜合評價預測

熵權法通過離散程度的研究，可表征單一指標與綜合評價之間的作用關系，在研究糯玉米[30]、藤茶[31]等食品的風味評定中得到應用。為進一步分析揮發性風味物質對牛奶氣味和風味的綜合作用，可運用熵權法分析各風味對牛奶綜合評價影響程度。由于脂肪酸含量差異，光氧化反應情況會有明顯差異，造成的牛奶風味變化差別顯著，而且無論是新鮮牛奶還是處理相同時間的牛奶，消費者感官評分均具有明顯差異性。針對這種特異性影響，需分別建立相關的特征性關系，確保對于不同不飽和脂肪酸含量牛奶變質的預測更為準確。為此分析消費者感官評分，確定了不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶的各風味物質指標權重（表8），預測風味分數和真實風味分數如圖4所示。

圖4 GM、UM、DM牛奶預測風味分數與真實風味分數Fig.4 Plots of predicted versus actual flavor scores of different formulations of UHT milk

表8 不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶的各指標權重Table 8 Weights of indicators of UHT milk with different e initial unsaturated fatty acid contents

因此建立UHT牛奶綜合評價的估算模型為：

通過分別建立不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶風味物質與時間的相關關系，再與真實風味分數進行聯系，可特征性表征消費者對于牛奶品質變化的喜好程度，對不同貯存條件下的不同配方牛奶品質隨時間變化進行預測。在實驗范圍內，真實分數預測值與消費者評價真實分數的誤差值在10%以內，表征和預測牛奶品質情況準確。相較于Singh[9]和Jiang Yujun[15]等僅對不同溫度條件下，特定配方乳制品品質進行評估和預測，本研究在溫度變化的基礎上，新引入光通量和初始不飽和脂肪酸含量多因素進行考究，更加完整地重現了實際儲運情況，將牛奶風味和品質變化考慮更加詳細，為未來研究提供了新的研究思路。

3 結論

研究考慮貯存溫度、光通量、不飽和脂肪酸初始含量等影響，開展3 種不同配方UHT牛奶的差異性風味變化分析，通過OPLS-DA法確定紙板味、油脂味、粉末味、苦味等是表征消費者感官最為準確的特征風味，隨后采用HS-SPME-GC-MS技術標定特征風味物質含量，相較于前人對于單一特定牛奶品質預測研究，創新性建立不同配方產品特異性風味物質與綜合評價之間的聯系，預測UHT牛奶在品質變化過程中的綜合評價變化，對不同配方UHT牛奶產品特征風味判別及預測提供參考和借鑒。