HS-SPME-GC-Orbitrap-MS法測定果酒中的醛酮類和呋喃類化合物

王 磊，王春光，劉雅冉，谷佩珊，劉佳妮，王麗衛，朱保慶,

（1.北京林業大學生物科學與技術學院，林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.上海可醇食品科技有限公司，上海 201317）

果酒是由不同種類的水果經發酵后制成的含酒精飲料，適合制作果酒水果原料包括但不限于枸杞、藍莓、山楂、荔枝等[1]。果酒保留了水果原料中部分營養物質，如人體必需的多種氨基酸、礦物質、維生素、多酚等天然營養成分，具有一定營養價值，適當飲用能夠促進消化、提高食欲[2]。隨著全球果酒消費市場的不斷擴大，果酒產品在酒精飲料消費中起著非常重要的作用。

果酒中關鍵揮發性化合物的組成決定果酒的香氣品質，進而影響消費者對產品的接受度。醛酮類和呋喃類均是果酒中潛在的重要呈香組分。醛酮類化合物能夠賦予果酒“植物香”、“果香”、“花香”等香氣屬性[3]，對果酒風味的構成有著重要的影響。然而，由于醛類化合物可以通過相應的前體物通過氧化形成，過度地氧化可能使果酒失去原有的“果香”香氣，給果酒帶來“氧化味”[4]，另外1-辛烯-3-酮等酮類物質濃度過高也會產生“泥土味”和“蘑菇味”等不愉悅的香氣[5]。呋喃類化合物能夠貢獻“甜香”、“烘烤香”、“堅果香”等香氣屬性[3]，通常在發酵或陳釀過程中產生[6]，但高含量的呋喃類化合物及其衍生物具有潛在的致癌毒性[7]。因此，監控果酒中醛酮類和呋喃類化合物含量有助于果酒品質的提升。

果酒中醛酮類和呋喃類化合物大多采用氣相色譜-質譜聯用技術進行檢測。現有的研究主要集中在葡萄酒中這兩類化合物的定性定量分析，例如，Mayr等[8]建立了衍生化結合固相萃取-氣相色譜-串聯質譜技術鑒定葡萄酒中包括己醛、糠醛在內的18 種“氧化味“化合物的檢測方法；固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法可以用于葡萄酒中包括呋喃類化合物內的多種雜環類化合物的檢測[9]；頂空固相微萃取（headspace-solid-phase microextraction，HS-SPME）-全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術也用于評價葡萄成熟度和浸漬對醛酮類和呋喃類化合物含量的影響[10]。然而，這些化合物在果酒中具有低含量、低閾值的特點，如1-辛烯-3-酮的閾值僅有40 ng/L，正壬醛和正辛醛的閾值也僅有1 μg/L和2.5 μg/L；同時，果酒往往采用不同水果發酵制成，果酒的基質相較于葡萄酒基質而言較為復雜，其在糖、酸、pH值等基質條件有所不同[11-13]。較低濃度和復雜的果酒基質對醛酮和呋喃類化合物的定量分析造成一定困難，因此需要建立適用于果酒中更準確的醛酮類和呋喃類化合物的檢測方法。

自2005 年Makarov 發明的靜電場軌道阱質譜（orbitrap-mass spectrometry，Orbitrap-MS）技術首次商業化以來，這種具有高分辨率和高靈敏度的質譜新技術在化合物的定性和定量分析方面顯示出巨大的優勢[14-17]，許多研究都集中在采用液相色譜聯用的代謝組學方面[18-19]。GC與Orbitrap-MS聯用后，其分辨率可以達到60000（m/z210，FWHM），質量精度可以達到1×10-6，靈敏度可以達到飛秒級，這為推進GC-MS技術的深度和廣度提供了更多的可能性[20-21]。目前，GC-Orbitrap-MS開始用于檢測農藥殘留[22]、兒童用品中的亞硝胺[23]、環境中的持久性有機污染物[24]、尿液中的興奮劑和違禁物質[25]以及代謝組學[26]。已有研究報道，GC-Orbitrap-MS可以對辣椒中的苯環化合物進行準確的定性定量[27]；前期使用HS-SPME-GC-Orbitrap-MS方法檢測果酒中內酯和揮發性酚類化合物的方法[28]。因此，GC-Orbitrap-MS是鑒定果酒中痕量香氣化合物的一種潛在技術。

以往的研究采用衍生化或固相萃取法對果酒中的醛酮類和呋喃類化合物進行提取制備，然而這些方法不易操作且較為耗時[8,29-30]。而HS-SPME法是一種無溶劑的樣品制備程序，具有快速、樣本量小的優點，適合于直接分析復雜基質中的揮發性化合物[31]。

本實驗在前期研究的基礎上，嘗試使用HS-SPMEGC-Orbitrap-MS檢測果酒中醛酮類和呋喃類化合物，并分別在模擬酒溶液、枸杞酒、藍莓酒和山楂酒中進行方法驗證，并利用此方法對不同果酒中這兩類化合物進行檢測，旨在建立一種適用果酒中醛酮類和呋喃類化合物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 款“北域時代”的藍莓酒，生產于2019年的干酒（B1），生產于2017年的干酒（B2）和生產于2019年的半干酒（B3）；1 款“生樺”的生產于2019年的藍莓干酒（B4）；1 款“伊村山野”的生產于2019年的藍莓干酒（B5），藍莓酒的乙醇體積分數均為12%，產自黑龍江。1 款“寧夏紅”2019年生產的枸杞半干酒，乙醇體積分數為7%（G1）；4 款“森淼”2017年生產的不同批次的乙醇體積分數11%枸杞干酒（G2～G5），枸杞酒產自寧夏；1 款“森淼”2016年生產的乙醇體積分數11%枸杞干酒（G6）。2 款“圣八禮”2019年生產的不同類型的乙醇體積分數12%山楂半干酒（H1、H2）；3 款“圣八禮”2020年生產的不同類型的乙醇體積分數13%山楂半干酒（H3～H5），山楂酒產自中國山東。模擬酒溶液參考Liu Yaran等[32]研究配制：20 g/L葡萄糖、6 g/L酒石酸、12%乙醇溶于純水中，并使用NaOH調pH值至3.0。所有實驗樣品均進行3 次重復測定。

1.2 儀器與設備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；TriPlus RSH自動進樣器、Trace 1300氣相色譜儀、Q Exactive靜電場軌道阱高分辨質譜德國Thermo Fisher Scientific公司；DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國J&W Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 高分辨質譜數據庫的建立

參考Liu Yaran等[32]的方法建立高分辨質譜數據庫。目標分析物的高分辨質譜圖是通過直接液體進樣的進樣方式獲得。以二氯甲烷為溶劑，目標化合物根據化合物結構，添加制成不同標準品混合溶液，分別記為醛酮類和呋喃類，目標化合物的加標量見表1。標準品混合溶液采用不分流的進樣方式，以1 μL的進樣量進樣，色譜圖如圖1所示。目標化合物的高分辨率質譜由軟件TraceFinder Software（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）導出為MSP文件，隨后用于鑒定分析果酒樣品中的目標化合物。液體進樣是在TriPlus RSH自動進樣器（Thermo Fisher Scientific,Bermen,Germany）上進行的。

圖1 使用GC-Orbitrap-MS分析標準品混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard mixtures analyzed by GC-Orbitrap-MS

表1 HS-SPME-GC-Orbitrap-MS方法中5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物標準品信息及添加量Table 1 Information about standards of five aldehydes and ketones and four furans and their spiked concentrations for HS-SPME-GCOrbitrap-MS analysis

1.3.2 HS-SPME

采用前期優化好的HS-SPME方法[32]提取樣品中的目標化合物。在15 mL頂空進樣瓶中加入1.00 g NaCl，再加入5 mL樣品和2 種內標化合物各10 μL（0.590 g/L薄荷醇、0.133 g/L對氟苯甲醛）。使用50/30 μm條件DVB/CAR/PDMS萃取頭進行萃取，在加熱臺60 ℃條件下，攪拌30 min，然后使用活化后的萃取頭插入小瓶的頂部空間，吸附30 min。萃取后取出萃取頭，立即插入GC進樣口在250 ℃下解吸10 min。

1.3.3 GC-Orbitrap-MS測定

采用DB-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），設定GC-Orbitrap-MS的條件如下[32]：載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min；升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min升溫至180 ℃，最后以3 ℃/min從180 ℃升溫至250 ℃并保持10 min，總時間為64 min；離子源溫度280 ℃；電子電離源；電離能為70 eV；質譜接口溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z33～300，質譜分辨率為60000（m/z200，FWHM）。

C6～C24正構烷烴用于計算目標化合物的保留指數。使用軟件TraceFinder Software（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）進行質譜解卷積，Xcalibur version4.1 中的Processing setup,Quan browser and Qual browser（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）對目標化合物進行定量。通過對比目標化合物的保留指數和離子碎片，對未加標果酒樣品中的目標化合物進行鑒定，其中每個目標化合物具有1 個定量離子碎片，1 個以上定性離子碎片用于定性，定量和定性離子碎片詳見表2。

表2 5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的信息Table 2 Information about five aldehydes and ketones,and four furans

1.3.4 方法評價

參考Liu Yaran等[32]的方法對所建立的方法進行評價，評價的指標包括：線性關系、基質效應（matrix effect，ME）、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、準確度、重復性和重現性。

線性關系是在4 種不同的果酒基質中進行評價，包括模擬酒溶液、枸杞酒（G2）、藍莓酒（B1）和山楂酒（H1）。根據果酒中目標化合物的濃度，將這些化合物分別添加到模擬酒溶液和真實果酒中，共稀釋得到12 個濃度梯度，涵蓋果酒樣品中各物質的濃度范圍。各濃度梯度的上述樣品經過與酒樣相同的前處理方法和GCOrbitrap-MS分析后，構建目標化合物濃度和定量離子碎片峰面積比的校準曲線。ME是通過比較各目標化合物在不同基質中校準曲線的斜率得到，按式（1）計算：

通過分析上述各濃度梯度樣品的信號強度，隨著目標化合物的濃度不斷降低，直到在3 種果酒基質（枸杞酒G2、藍莓酒B1和山楂酒H1）中，連續稀釋濃度之間目標化合物的峰面積無顯著差異（P＜0.05）確定物質在各基質中的LOD。然后根據LOD和LOQ的信噪比分別為3和10計算得到LOQ。

方法的準確度通過各目標化合物在不同果酒基質中的加標回收率進行評價。根據果酒中目標化合物的濃度，在3 種不同果酒基質中添加目標化合物，目標化合物的加標量見表1。然后利用各基質對應的校準曲線計算加標和未加標的果酒樣品，對目標化合物進行定量分析。最后，按式（2）計算加標回收率：

方法的重復性和重現性，在果酒（枸杞酒G2）樣品中，添加目標化合物進行測定，目標化合物的添加量見表1。方法的重復性（日內精密度）是在1 d之內連續重復6 次測定上述加標酒樣，方法的重現性（日間精密度）是6 d之內重復6 次測定上述加標酒樣。方法的重復性和重現性均以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示最終結果。

1.4 數據統計與分析

高分辨質譜圖的繪制使用Origin 8.0完成。果酒中目標化合物含量的對數值和氣味活度值（odor active value，OAV）的氣泡圖采用R語言中的“ggplot”包完成。

2 結果與分析

2.1 高分辨質譜數據庫的建立

NIST和Wiley等商業質譜數據庫中，大部分揮發性化合物的質譜是通過氣相色譜-單四極桿質譜聯用儀（GCquadrupole-MS）獲得的低分辨率質譜圖。然而，根據本實驗的結果發現GC-Orbitrap-MS和GC-quadrupole-MS獲得的質譜信息在某些特定化合物上有很大的差異。

醛酮類化合物如正己醛、正壬醛、正辛醛和2-壬酮在高/低分辨質譜圖的離子豐度具有明顯差異（圖2）。正己醛在高分辨質譜圖中，m/z57.03345的豐度較高，然而在低分辨率質譜中m/z56的豐度明顯高于m/z57；正壬醛的低分辨率質譜圖中豐度較高的離子碎片有m/z41、46、44、56、57，然而在高分辨率質譜圖中豐度較高點的離子碎片僅有m/z41.03837、67.05425和m/z81.06989；正辛醛中高分辨率質譜圖中豐度最高的離子碎片是m/z41.03834，在低分辨率質譜圖中豐度最高的離子碎片則是m/z43；在2-壬酮的高分辨率質譜圖中m/z58.04137的豐度遠低于m/z43.0178，然而在低分辨率質譜圖中m/z43和m/z58的豐度接近。另外，1-辛烯-3-酮在高分辨率質譜圖中檢測到m/z97.06477，然而在低分辨率質譜圖中未檢測到m/z97的碎片。

圖2 5 種醛酮類化合物高分辨質譜和低分辨質譜圖的對比Fig.2 High-resolution mass spectra and low-resolution mass spectra of five aldehydes and ketones

呋喃類化合物中乙酰呋喃和2-糠酸乙酯在高/低分辨率質譜圖中檢測到的離子碎片及其豐度差異不明顯，然而在糠醛和糠醇的高/低分辨率質譜圖中具有明顯差異（圖3）。雖然高分辨率質譜掃描的范圍是m/z33～300，但是在糠醇的高分辨率質譜圖中未檢測到m/z33～80的離子碎片，在糠醇的低分辨率質譜圖中m/z41、53、69、70和其他m/z33～80的離子碎片；在糠醛的低分辨率質譜圖中主要檢測到的離子碎片是m/z95、96和m/z39，然而在高分辨率質譜圖中，檢測到的主要離子碎片是m/z43.0178、58.04137和m/z71.04919。

圖3 4 種呋喃類化合物高分辨質譜和低分辨質譜圖的對比Fig.3 High-resolution mass spectra and low-resolution mass spectra of four furans

高分辨率質譜和低分辨率質譜存在明顯差異的現象與前人研究結果一致[33]。有研究發現在70 eV的電子電離源下，Orbitrap-MS會改變部分化合物的質譜信息，如產生不同離子碎片、改變離子碎片的相對豐度[34]。在本實驗中，也發現了相同的現象，這可能是由于這些離子碎片在靜電場軌道阱中的捕獲效率較低所導致[20]。當與NIST、Wiley等常見質譜數據庫進行比對時，Orbitrap-MS產生的質譜信息的改變可能直接影響這些化合物定性的準確性。因此，使用GC-Orbitrap-MS檢測揮發性香氣化合物需建立目標化合物的高分辨質譜信息數據庫，方可保證定性的準確性。

本實驗在先前的研究基礎上，在香氣化合物索引數據庫[35]（http://foodflavorlab.cn/）中，補充5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的相關信息。該數據庫不僅提供目標化合物的高分辨質譜信息（離子碎片和相對豐度），還提供香氣化合物的基本信息，如：保留指數、CAS號、化學結構圖、香氣描述和葡萄酒的香氣閾值。為鑒定果酒中的目標化合物，選用高分辨質譜中質量偏差不大于5×10-6的定量和定性離子碎片進行比對。在使用Orbitrap-MS進行定性定量時，可參考該數據庫中的高分辨質譜信息，從而保證定性定量的準確性，目標化合物的定量和定性離子碎片信息見表2。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關系和ME

對3 種果酒基質的線性關系進行評價，包括模擬酒溶液、枸杞酒、藍莓酒和山楂酒。使用簡單的線性回歸擬合校準曲線，所有目標化合物的R2值均大于0.99，線性范圍如表3所示。上述校準曲線能夠涵蓋所有目標化合物在不同果酒樣品中的不同濃度。

表3 HS-SPME-GC-Orbitrap-MS方法中5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的線性范圍和METable 3 Linearity ranges and matrix effects for optimized HS-SPMEGC-Orbitrap-MS analysis of five aldehydes and ketones,and four furans

為評價果酒基質對目標化合物響應的影響，比較模擬酒溶液與3 種真實果酒基質中各目標化合物的斜率。表3列出所有目標化合物在不同果酒基質下的ME值。藍莓酒、枸杞酒和山楂酒中醛酮類化合物的ME值分別為-7%～64%、-41%～130%、-41%～102%；呋喃類化合物的ME值分別為-33%～49%、-33%～117%、-33%～138%。由于不同化合物在不同果酒基質中的ME明顯不同，因此不同基質的樣品在進行定量時，需要建立與基質匹配的校準曲線使其定量更為準確。研究表明，ME絕對值小于20%可以認為是輕微的ME，介于20%和50%之間可以認為是中等的ME，而大于50%可以認為是增強的ME[36]。如表3所示，大部分醛酮和呋喃化合物在不同果酒中表現出中等的基礎效應，在不同果酒中的基質效應有所差別。因此，在對不同果酒醛酮類和呋喃類化合物進行定量時，建議選用基質更接近的線性關系計算濃度。

2.2.2 LOD和LOQ

如表4 所示，醛酮類化合物的LOD 范圍為0.004～0.88 μg/L，呋喃類化合物LOD 的范圍為0.13～6.30 μg/L；醛酮類化合物LOQ 的范圍為0.01～2.93 μg/L，呋喃類化合物LOQ 的范圍為0.20～21.00 μg/L。所有目標化合物的LOD在3 種果酒中都具有差異，這可能是ME所導致。研究結果表明，除乙酰呋喃、2-糠酸乙酯和糠醇未檢索到香氣閾值外，其他目標化合物的LOD都遠低于其相應的香氣閾值，因此，本實驗建立的方法能夠成功地評價目標化合物對果酒香氣的貢獻。

表4 不同果酒基質中5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的LOQ、LOD、準確度和精確度Table 4 Accuracy,precision,LOQ and LOD of five aldehydes and ketones,and four furans in different wine matrices

2.2.3 準確度、重復性與重現性

如表4所示，3 種果酒中所有目標化合物的加標回收率均在81%～120%之間，說明該方法準確可靠。該方法的重復性和重現性（精密度）通過計算RSD評價，重復性在1 d之內重復檢測6 次，RSD在8.80%～18.49%之間；重現性在不同日期進行檢測，共進行6 次重復，RSD在1.74%～19.08%之間。穩定的實驗室環境對提高方法的準確度和精密度至關重要，上述實驗都是在穩定的實驗室環境溫度下進行檢測。通過上述指標可以證明，本實驗所開發的HS-SPME-GC-Orbitrap-MS方法準確且穩定，可以滿足果酒中醛酮類和呋喃類化合物的檢測要求。

2.3 果酒中醛酮類和呋喃類化合物的濃度分析

將所優化建立的方法應用于檢測不同種類果酒的目標化合物，包括6 種枸杞酒、5 種藍莓酒和5 種山楂酒。

2.3.1 5 種醛酮類化合物

如表5和圖4所示，醛類化合物在3 種果酒中的質量濃度范圍分別為：枸杞酒0.72～7.72 μg/L，藍莓酒0.77～12.22 μg/L，山楂酒0.58～6.15 μg/L。酮類化合物在枸杞酒和山楂酒中的質量濃度范圍分別為0.63～1.86 μg/L和0.42～0.44 μg/L，藍莓酒中不含有酮類化合物。如表5和圖5所示，該方法所檢測到的3 種醛類化合物中，僅有壬醛在果酒中達到香氣閾值。在藍莓酒中OAV的分布范圍是2.13～12.22；而在枸杞酒和山楂酒中，各僅有1 款果酒壬醛的質量濃度能夠達到香氣閾值，其OAV值分別為5.95和6.15。壬醛在果酒中能夠貢獻“脂香”、“玫瑰”和“橘子”的香氣。2 種酮類化合物中僅有1-辛烯-3-酮在藍莓酒和山楂酒的OAV大于1，其在所有藍莓酒中均達到香氣閾值，其OAV值的分布范圍是21.54～23.63，在3 種達到香氣閾值的山楂酒中OAV的分布范圍是10.51～10.91。

圖4 不同果酒中目標化合物質量濃度氣泡圖Fig.4 Bubble plot of contents of analytes in blueberry wine

圖5 不同果酒中目標化合物OAV氣泡圖Fig.5 Bubble plot of OAVs of analytes in blueberry wine

表5 不同果酒中5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的平均質量濃度、質量濃度范圍和OAVTable 5 Average concentrations,concentration ranges and odor activity values (OAVs) of five aldehydes and ketones,and four furans in different fruit wines

2.3.2 4 種呋喃類化合物

如表5和圖4所示，山楂酒中呋喃類化合物的含量較高，質量濃度范圍是0.89～59492.99 μg/L，其次是枸杞酒，其呋喃化合物的質量濃度范圍為0.26～4238.37 μg/L，藍莓酒中呋喃類化合物的含量最少，質量濃度范圍僅為1.69～39 μg/L。山楂酒中4 種呋喃類化合物的含量都較高，特別是糠醛的含量能夠達到50 mg/L，其他3 種呋喃類化合物在部分山楂酒酒樣中也能夠達到1 mg/L。枸杞酒中糠醛和糠醇的含量較高，能夠達到1.5 mg/L。如圖5所示，僅有H2酒樣中糠醛的質量濃度能夠達到香氣閾值（OAV=4.22），糠醛在果酒中能夠貢獻“甜香”、“烘烤香”、“木香”和“烤面包”的香氣[3]。

3 結論

建立一種利用HS-SPME-GC-Orbitrap-MS同時測定果酒中5 種醛酮類和4 種呋喃類化合物的方法，并建立高分辨質譜數據庫用于準確定性。該方法具有較高的靈敏度，能夠有效對上述化合物進行定量。同時，樣品制備簡單，僅需要少量的樣品即可進行檢測。由于ME的影響，針對不同果酒樣品，需要建立與基質匹配的校準曲線。使用該方法確定了藍莓酒、枸杞酒和山楂酒中目標化合物的濃度范圍，為后續果酒品質的提升奠定基礎。本研究的開展能夠快速、準確、高效地完成果酒中醛酮類和呋喃類化合物的定性定量分析，對評價這些化合物對果酒香氣的貢獻具有重要意義。