菜豆R2R3-MYB基因家族鑒定及其在BCMV侵染后的表達分析

王古悅，唐慕寧，牛靜雅，馮雪

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

轉錄因子由DNA結合域、轉錄調控區、核定位信號和寡聚位點4個功能域組成[1]。根據DNA結合域的特異性，可將轉錄因子分為若干個不同的家族[2]。MYB基因家族是植物最大的轉錄因子家族之一，根據結構數不同又可將MYB劃分為4個亞家族：1R-MYB（MYB-related）、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB（3R-MYB）、4R-MYB[3]。其中，R2R3-MYB亞家族是MYB轉錄因子中最豐富的一類，在植物生長發育、次生代謝和非生物/生物脅迫中起著重要的作用[3-5]。目前，在擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）[3]、甜櫻桃（Prunus aviumL.）[6]、煙草（Nicotiana tabacumL.）[7]等多種植物中鑒定出R2R3-MYB基因家族成員。李彤等[8]用VIGS基因沉默技術和實時熒光定量PCR發現，番茄SlMYB28參與調控番茄黃葉卷曲病毒侵染；張亞麗等[9]在蘋果愈傷組織中過表達MdMYB30并結合實時熒光定量PCR發現，蘋果MdMYB30可增強對病原菌的抗性；邱正坤等[10]利用VIGS基因沉默和過表達技術發現，茄子SmMYB44可增強對青枯病的抗性等。然而，關于菜豆R2R3-MYB基因家族成員的數量和特點還未見報道。

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）又稱蕓豆，是豆類食物來源之一，因其營養豐富、用途多樣而備受關注[11]。菜豆普通花葉病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）是菜豆及其他豆類上最常見和危害最嚴重的病毒之一。BCMV侵染菜豆后可引起花葉、矮縮、畸形、壞死等癥狀，嚴重時可造成絕收[12-13]。本研究通過對菜豆R2R3-MYB基因家族成員進行鑒定和綜合分析，包括理化性質、基因結構、順式作用元件、染色體定位、共線性分析、BCMV侵染后的基因表達模式等，旨在解析菜豆R2R3-MYB基因家族成員在BCMV侵染后的生物學功能。

1 材料和方法

1.1 菜豆R2R3-MYB基因家族成員鑒定及特征分析

從Phytozome v13數據庫（https://phytozomenext.jgi.doe.gov/）下載菜豆參考基因組序列和注釋文件。從TAIR數據庫（http://plants.ensembl.org/index.html/）下載擬南芥參考基因組序列和注釋文件，將126個擬南芥R2R3-MYB蛋白序列作為靶序列，通過TBtools、NCBI的Blast（http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/）、NCBI的Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/cdd/?term=）分析，剔除沒有MYB結構域、MYB結構域不完整或重復的序列，并利用SoftBerry網站（http://linux1.softberry.com/）補全剪接不完整的序列。利用ExPASy網站（https://web.expasy.org/protparam/）預測菜豆R2R3-MYB基因家族成員的理化性質。利用CELLO v.2.5網站（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預測。利用MUSCLE對菜豆R2R3-MYB進行多序列比對，后利用TBtools軟件進行可視化。

1.2 菜豆R2R3-MYB基因家族成員系統進化分析

利用MEGA-X軟件采用鄰接法，校驗參數Bootstrap設置為1 000，其他參數保持默認值，構建系統進化樹。利用iTOL網站（https://itol.embl.de/）美化進化樹。

1.3 菜豆R2R3-MYB基因家族成員保守基序、基因結構、順式作用元件分析

利用MEME網站（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）預測菜豆R2R3-MYB基因家族成員的保守基序序列，設置最大基序數為20，其他參數保持默認值。利用TBtools軟件提取菜豆R2R3-MYB基因家族成員起始密碼子上游2 kb序列信息，并利用PlantCARE網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測順式作用元件。

1.4 菜豆R2R3-MYB基因家族成員染色體定位及共線性分析

根據菜豆基因組注釋文件，得到基因在染色體上的位置信息，并利用TBtools軟件進行可視化。利用TBtools軟件分析菜豆基因組內和菜豆與擬南芥基因組間的共線性關系，并計算每對復制事件的非同義替代率（Ka）、同義替代率（Ks）和Ka/Ks值。根據Ks值和突變率λ=1.5×10-8，估計菜豆復制事件分化時間（T=Ks/2λ）[14]。

1.5 菜豆R2R3-MYB基因家族成員在BCMV侵染后的轉錄組分析

以菜豆Dubbele Witte（DW）為試驗材料，于28 ℃（光照16 h）/25 ℃（黑暗8 h），相對濕度50%的人工培養箱生長。在菜豆DW子葉完全展開時，BCMV分離物C54摩擦接種菜豆DW，PBS溶液摩擦菜豆DW作為對照組，接毒14 d后分別采集接種葉和系統葉，所有樣品于液氮速凍后送至北京百邁客生物科技有限公司進行RNA-Seq分析。FPKM值進行Log2（FPKM+1）轉換并利用TBtools軟件繪制表達熱圖，以|FC|≥1.5且FDR＜0.05作為篩選差異表達基因的標準，每個處理設置3次生物學重復。

1.6 實時熒光定量PCR分析

分別采集0、2、4、8、16 h和1、3、5、7、14、21 d的葉片，利用Trizol（Biosharp，中國）提取葉片總RNA，使用Hiscript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR反轉錄試劑盒（Vazyme，中國）合成cDNA。利用IDT網站（https://sg.idtdna.com/pages）設計基因特異性引物（表1），以Act11為內參基因[15]，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Vazyme，中國）在實時熒光定量PCR儀上進行試驗。

反應體系為20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL。PCR反應程序為：95 ℃3 min；95 ℃ 10 s和60 ℃ 15 s進行40個循環；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。設置3次技術重復，采用2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量，利用GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 菜豆R2R3-MYB基因家族成員染色體定位

利用TAIR、SoftBerry、NCBI、TBtools等工具對菜豆R2R3-MYB基因家族成員進行篩選和鑒定，最終得到159個R2R3-MYB基因家族成員，其中157個不均勻分布在11條染色體上，依據在染色體的排列順序分別命名為PvMYB1～PvMYB157；而PvMYB158和PvMYB159未定位到染色體。染色體定位結果顯示，3號染色體分布的基因最多，有21個，而6號染色體分布的基因最少，只有8個。大多數基因聚集在染色體兩端（圖1）。

2.2 菜豆R2R3-MYB基因家族成員鑒定及特征分析

理化性質分析可見，159個菜豆R2R3-MYBs編碼蛋白的長度為184～554個氨基酸，分子質量為20 692.45～61 028.67 u，等電點為4.79～10.34，所有蛋白親水性值小于0，158個蛋白不穩定系數大于40，亞細胞定位預測顯示，155個成員位于細胞核（表2）。

R2和R3重復序列顯示，R2結構域中有3個保守的色氨酸殘基（W），3個色氨酸殘基之間相隔19個氨基酸殘基（圖2-A）。R3結構域中只發現2個色氨酸殘基（W），而第1個色氨酸殘基被疏水氨基酸替代，如苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）、亮氨酸（L），3個保守氨基酸殘基之間相隔18個氨基酸殘基（圖2-B）。同時，在R2重復中的G-4、E-10、D-11、L-14、G-22、L-35、R-37、K-40、C-42、R-43、R-45、N-48、L-50、P-52和R3重復中的E-10、G-22、I-28、A-29、P-33、G-34、R-35、T-36、D-37、N-38、K-41、N-42高度保守。

圖2 菜豆R2R3-MYB基因家族成員的R2（A）和R3（B）重復序列標識Fig.2 Sequence logos of the R2（A）and R3（B） repeats of R2R3-MYB gene family members in common bean

2.3 菜豆R2R3-MYB基因家族成員系統進化分析

將159個菜豆R2R3-MYB蛋白序列和126個擬南芥R2R3-MYB蛋白序列構建系統進化樹，根據與擬南芥序列的相似性和拓撲結構，將菜豆R2R3-MYB基因家族成員劃分為32個亞組（P1～P32）（圖3），大多數亞組包含菜豆和擬南芥成員，如P2、P3、P16亞組等；P1、P15亞組不包含擬南芥成員，而在菜豆中沒有發現與擬南芥S12亞組聚類的成員。

圖3 菜豆（☆）與擬南芥（★）R2R3-MYB基因家族成員的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the R2R3-MYB gene family members between common bean（☆）and Arabidopsis thaliana（★）

2.4 菜豆R2R3-MYB基因家族成員保守基序、基因結構、順式作用元件分析

從159個菜豆R2R3-MYB基因家族成員所編碼的蛋白序列中，共預測了20個保守基序（圖4-B）。多數成員具有5個保守基序并按Motif 3、Motif 4、Motif 2、Motif 7、Motif 1依次排列在N端。一些亞組的成員在C端檢測到特殊基序，如P22亞組中檢測到Motif 11，P32亞組中檢測到Motif 20，表明這些基因可能具有獨特功能。菜豆R2R3-MYB基因家族成員包含0～13個內含子（圖4-C）。PvMYB1、PvMYB18、PvMYB53、PvMYB117、PvMYB122未發現內含子，而PvMYB23內含子數最多。

圖4 菜豆R2R3-MYB基因家族成員的系統發育樹（A）、保守基序（B）和基因結構（C）Fig.4 Phylogenetic tree（A），conserved motif（B），and gene structure（C）of R2R3-MYB gene family members in common bean

在菜豆R2R3-MYB基因家族成員起始密碼子上游2 kb啟動子區，共預測到58種順式作用元件，可將其分為植物生長發育、光響應、植物激素反應、非生物/生物脅迫四大類（圖5）。

圖5 菜豆R2R3-MYB基因家族成員啟動子區的順式作用元件Fig.5 Cis-elements in promoter region of R2R3-MYB gene family members in common bean

植物生長發育包含8種元件，其中CAT-box（分生組織表達）占比最高，為32.75%；其次是GCN4_motif（胚乳表達），占比23.56%。光響應包含28種元件，其中，Box 4占比最高，為32.95%；其次是G-box，占比16.96%。植物激素反應包含14種元件，其中ABRE（脫落酸響應）占比最高，為33.19%；其次是CGTCA-motif（茉莉酸響應）和TGACG-motif（茉莉酸響應），均占比13.23%；再次為TCA-element（水楊酸響應），占比11.31%。非生物/生物脅迫包含8種元素，其中ARE（厭氧誘導）占比最高，為50.50%；其次是MBS（干旱誘導），占比14.49%；再次為TC-rich repeats（防御和應激反應），占比11.76%。

2.5 菜豆R2R3-MYB基因家族成員共線性分析

菜豆基因組內的共線性分析顯示，在不同的染色體上共有72對片段復制事件（圖6）。片段復制事件的Ks值為0.519 8～5.436 9，表明該復制事件很可能發生在17百萬～181百萬年。串聯復制事件的Ks值為0～2.948 9，表明該復制事件很可能發生在0～98百萬年；這些復制事件的Ka/Ks值均小于1，表明這些基因均經歷了純化選擇，在很大程度上有助于維持菜豆R2R3-MYB基因功能。

圖6 菜豆R2R3-MYB基因家族成員的共線性分析Fig.6 Collinearity analysis of R2R3-MYB gene family members in common bean

2.6 菜豆R2R3-MYB基因家族成員在BCMV侵染后的表達分析

轉錄組數據明確了BCMV分離物C54侵染菜豆感病品種DW后寄主在顯癥期時的葉片基因表達水平（登錄號PRJNA900512）。去除不表達或低表達水平（FPKM＜0.5）的基因，最終得到67個菜豆R2R3-MYB基因家族成員的表達熱圖（圖7）。

圖7 BCMV侵染菜豆后R2R3-MYB基因家族成員的表達熱Fig.7 Heatmap of R2R3-MYB gene family members expression in common bean after BCMV infection

圖7結果表明，與對照組相比，在接種葉和系統葉中共有53個差異表達基因：接種葉有20個差異表達基因，其中11個上調，9個下調；系統葉有33個差異表達基因，其中20個上調，13個下調。基于轉錄組數據，發現PvMYB18、PvMYB29、PvMYB33、PvMYB92、PvMYB93、PvMYB97、PvMYB128、PvMYB124、PvMYB134等基因在受到侵染后表達量差異較大。

為分析菜豆R2R3-MYB家族基因成員在顯癥期的表達水平，對上述差異較大的9個基因進行在BCMV侵染不同時間下的qRT-PCR，結果表明（圖8），在BCMV侵染早期，所有基因的相對表達量均有上調：其中，PvMYB18、PvMYB124、PvMYB134在2 h時上調幅度最大；PvMYB29、PvMYB33、PvMYB92、PvMYB128在4 h時上調幅度最大；PvMYB97和PvMYB93則分別在8、16 h時上調幅度最大。在病毒侵染后不斷復制直至寄主顯癥期，PvMYB33、PvMYB92、PvMYB93的表達量呈先升高后降低的趨勢，在7 d時相對表達量最高。

圖8 BCMV侵染菜豆后菜豆R2R3-MYB基因家族成員的相對表達量Fig.8 Relative expression of R2R3-MYB gene family members in common bean after BCMV infection

3 結論與討論

本研究從菜豆基因組中鑒定到159個R2R3-MYB基因家族成員，其中有2個基因沒有定位到染色體上，可能是由基因組注釋不全造成的。少數基因在C端有一些特殊基序，如motif 14、motif 20，這可能是成員功能多樣性的重要原因。菜豆R2R3-MYB蛋白由高度保守的MYB結構域組成，R2重復序列有3個高度保守的色氨酸殘基，而R3重復序列在第1個色氨酸殘基處存在多樣性，這與擬南芥報道一致[16]。系統進化分析表明，大多數亞組包含菜豆和擬南芥成員，表明它們來自共同的祖先。而一些亞組不含擬南芥成員，這可能與菜豆和擬南芥的物種特異性適應有關。在菜豆R2R3-MYB基因家族中，有72對片段復制事件和18對串聯復制事件，表明片段復制事件對其擴增起著重要的作用，這與馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）報道一致[17]。

菜豆R2R3-MYB基因家族成員上游調控區發現，ABRE、CGTCA-motif、TCA-element、TGACG-motif、TC-rich repeats等順式作用元件分別與脫落酸響應、茉莉酸響應、水楊酸響應、防御和應激反應相關。已有報道，病毒侵染可以影響植物體內脫落酸含量[18]；茉莉酸是對死體營養型病原體和昆蟲侵襲的防御反應的調節劑[19]；水楊酸可以影響病毒在受侵染植物體內細胞間運輸、長距離移動和復制[20]。這些結果預示了菜豆R2R3-MYB基因家族成員在生物脅迫響應中的潛在作用。

通過qRT-PCR檢測了菜豆R2R3-MYB基因家族成員在BCMV侵染后不同時刻的相對表達水平：9個目標基因在BCMV侵染后早期均出現上調，PvMYB33、PvMYB92、PvMYB93在顯癥期出現顯著上調。其中，PvMYB33和PvMYB97與擬南芥S20亞組聚為一類，S20亞組成員AtMYB108在脫落酸誘導的細胞死亡中起調控作用[21]；PvMYB92與擬南芥S2亞組聚為一類，S2亞組成員AtMYB15的過表達可以改善擬南芥的耐旱性和耐鹽性[22]；PvMYB93和PvMYB124與擬南芥S14亞組聚為一類，S14亞組成員AtMYB36、AtMYB37、AtMYB84、AtMYB87與植物生長發育相關[23-24]。此外，PvMYB18與擬南芥S22亞組聚為一類，S22亞組成員AtMYB44可以激活水楊酸介導的防御反應，調節對生物營養型病原體丁香假單胞菌的抗性[25]。PvMYB29與擬南芥S11亞組聚為一類，S11亞組成員AtMYB102有助于擬南芥抵抗菜青蟲的取食[26]。PvMYB128與擬南芥S4亞組聚為一類，S4亞組成員AtMYB3、AtMYB4、AtMYB7、AtMYB8、AtMYB32屬于一般苯丙素代謝和木質素阻遏劑，木質素有助于植物對生物和非生物脅迫的反應[27-28]。PvMYB134與AtMYB82聚類在一個分支上，AtMYB82參與毛狀體發育的調控，擬南芥毛狀體細胞可以感知外部機械刺激而誘導防御相關基因的表達[29-30]。因而推測這些基因可能直接或間接地參與了菜豆感性品種對BCMV侵染應答的調控，但菜豆R2R3-MYB基因家族成員在BCMV侵染過程中具體作用的分子機制及這些基因是否具有組織特異性還有待進一步研究。

本研究通過生信分析，明確了菜豆R3R3-MYB基因家族共有159個成員，其中157個成員不均勻分布于11條染色體上，依次命名為PvMYB1～PvMYB157，而PvMYB158和PvMYB159未定位在染色體上。系統發育樹可將其分為32個亞組，順式作用元件分析發現，該家族成員含有多種逆境響應元件。qRT-PCR結果顯示，PvMYB33、PvMYB92、PvMYB93在4 h和7 d時有較高的表達量，PvMYB29、PvMYB97、PvMYB124、PvMYB128、PvMYB134在侵染早期出現較高的表達量，推測它們在菜豆受到BCMV侵染后的不同階段發揮著重要作用，為了解菜豆R2R3-MYB基因家族的生物學功能提供理論基礎。