乙型肝炎肝硬化并發自發性細菌性腹膜炎患者外周血單個核細胞NLRP3和Caspase-1水平變化及其臨床意義探討*

馮冬霞,奚 晶,楊振斌,劉亞芹,胡茜瑩

乙型肝炎肝硬化患者營養狀態較差,免疫力低下,極易出現各種感染。自發性細菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是失代償期肝硬化患者最易發生的腹腔感染,是指病原微生物侵入腹腔,造成明顯損傷的感染,可迅速發展為肝腎功能衰竭,導致病情進一步惡化,是肝硬化等終末期肝病患者死亡的主要原因之一[1,2]。有報道顯示,炎癥介質參與了SBP的發生發展過程。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體主要由NLRP3和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)組成,可參與促炎因子白細胞介素(interleukin,IL)的成熟和釋放過程[3,4]。相關研究指出,機體NLRP3炎性小體活化可導致白細胞介素大量釋放,激活Caspase-1凋亡通路,引起炎癥反應的放大[5]。本研究旨在探究乙型肝炎肝硬化并發SBP患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)NLRP3和Caspase-1水平變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2018年1月～2020年5月我院診治的乙型肝炎肝硬化并發SBP患者65例,男42例,女23例;年齡為41～73歲,平均年齡為(53.5±3.1)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的診斷標準[6],SBP符合《肝硬化腹水及相關并發癥的診療指南》的診斷標準[7,8]:(1)有以下癥狀或體征之一:①急性腹膜炎的表現:出現嘔吐、腹瀉,腹部壓痛或反跳痛,腹肌張力增高;②全身炎癥反應綜合征的表現:發熱或體溫不升、寒戰、心動過速等;③無誘因肝功能指標惡化;④肝性腦病;⑤休克;⑥頑固性腹水或腎功能衰竭;⑦急性胃腸道出血。(2)有以下實驗室檢查異常之一:①腹水多形核白細胞計數≥0.25×109/L;②腹水細菌培養陽性;③血清降鈣素原(procalcitonin,PCT)>0.5 ng/mL。根據嚴重程度將SBP分為輕癥組和重癥組。滿足以下任何2項者,診斷為SBP重癥感染:①體溫>39℃;②感染性休克;③急性呼吸窘迫綜合征;④不明原因的急性腎損傷3期;⑤外周血白細胞>10.0×109/L ;⑥血清降鈣素原>2 ng/mL。排除標準:(1)合并其他臟器器質性疾病;(2)肝細胞癌;(3)其他病因導致的肝硬化;(4)合并自身免疫性疾病、酒精性肝病或藥物性肝損傷;(5)合并消化道出血。本研究符合《赫爾辛基宣言》及其附錄準則。

1.2 PBMCs NLRP3和Caspase-1水平檢測 入院24 h內采集空腹靜脈血3 ml,置于EDTA抗凝管中靜置,以1:1將人外周血與淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)混合,使用LB-5000型醫用離心機(上海趙迪生物科技有限公司)3000 r/m離心10 min,分離PBMCs。再將Trizol加入裝有PBMCs的試管,保存于-80℃、備用。應用大連寶生物有限公司提供的mRNA提取試劑盒提取PBMCs 總RNA,使用康為世紀反轉錄試劑盒進行反轉錄,qPCR引物由上海生工公司設計和合成(表1)。使用大連寶生物有限公司熒光定量試劑盒建立反應體系,使用7500型實時熒光定量PCR儀(Life Technoligies Holdings Pte Ltd)檢測PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平。

表1 引物序列

1.3 血清IL-1β和IL-18水平檢測 采用ELISA法檢測血清IL-1β和IL-18水平(濟南來寶醫療器械有限公司)。

2 結果

2.1 輕癥與重癥組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較 重癥組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥組(P<0.05,表2)。

表2 兩組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較

2.2 各指標評估病情嚴重程度的價值 PBMCs NLRP3聯合Caspase-1水平評估SBP患者病情嚴重的AUC顯著大于各指標單獨預測(P<0.05,表3、圖1)。

圖1 各指標評估病情嚴重程度的ROC曲線

表3 各指標評估病情嚴重程度的價值

2.3 死亡組與生存組PBMCs NLRP3和Caspase-1及血清白介素水平比較 死亡組NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于生存組(P<0.05,表4)。

表4 死亡組與生存組NLRP3和Caspase-1及白介素水平比較

2.4 PBMCsNLRP3和Caspase-1及血清白介素水平預測預后的價值 應用PBMCs NLRP3聯合Caspase-1水平預測患者預后的AUC顯著大于各指標單獨檢測(P<0.05,表5、圖2)。

圖2 各指標預測預后的ROC曲線

表5 各指標預測預后的價值

3 討論

SBP是指在肝病伴有腹水的基礎上,無腹腔內感染灶和臟器破損,也無其他直接污染途徑存在時發生的腹膜細菌感染。在肝硬化腹水患者較常見,也發生于急性肝衰竭或腎病綜合征的[9,10]。肝硬化腹水患者因長期營養不良及免疫功能低下,單核-巨噬細胞系統和中性粒細胞系統功能減弱、肝功能受損導致抗感染能力下降,易并發SBP[11]。近年來,炎癥小體及下游炎性因子在肝炎等肝臟疾病發病過程中的作用受到廣泛關注。炎癥小體是NLRP及其形成的多蛋白水解復合物,在多種疾病發病過程中具有重要作用[12,13]。NLRP3炎性小體屬于NLRs家族,是一種由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白和Caspase-1組成的蛋白復合體。NLRP3可通過刺激細胞表面Toll受體或激活凋亡相關斑點樣蛋白方式,促進NLRP3炎性小體形成,進而促使NLRP3和Caspase-1 mRNA水平上調。IL-18和IL-1β是NLRP3炎性小體分泌的炎性因子,IL-18可促進肥大細胞等分泌Th2細胞因子,以增強免疫應答;IL-1β可促進嗜酸性粒細胞聚集,維持相關細胞因子水平[14,15]。本研究發現,重癥SBP組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥組,提示PBMCs NLRP3和Caspase-1水平與SBP嚴重程度有關,主要是因為細菌感染可激活NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子,加重肝臟炎癥反應。當機體受到細菌感染時,炎癥小體可作用于關鍵的調節及轉錄因子,激活炎性介質,加重局部炎癥反應,促進肝臟病變進展。另外,本研究結果顯示,應用NLRP3和Caspase-1水平聯合檢測評估病情嚴重程度的AUC為0.899,提示聯合檢測對乙型肝炎肝硬化并發SBP患者病情嚴重程度具有評估價值。

SBP是肝硬化腹水患者的一種常見而嚴重的并發癥,多見于晚期肝硬化和其它一些重癥肝炎患者,是終末期肝病患者的重要死亡原因之一[16]。隨著對SBP早期診斷和治療水平的提高,其病死率有所下降,但整體病死率仍處于較高水平。相關研究指出,SBP患者肝臟炎癥狀態與預后相關[17,18]。NLRP3可影響體內炎癥信號通路激活,促進IL-18等炎癥介質釋放,導致肝臟間質細胞纖維化改變[19,20]。本研究發現,死亡組PBMCs NLRP3和Caspase-1 mRNA水平及血清IL-1β和IL-18水平顯著高于生存組,提示它們可能與患者預后有關。NLRP3和Caspase-1異常水平可導致肝臟上皮細胞線粒體損傷和線粒體膜完整性破壞,并可促進局部炎性介質釋放,加劇炎性細胞對肝臟上皮組織的損害,而進一步促進肝臟上皮細胞凋亡和壞死[21,22]。抑制機體NLRP3和Caspase-1水平上調,減輕局部炎性介質對肝臟組織的損傷,或可起到延長患者生存期和改善預后的作用。本研究發現,應用PBMCs NLRP3和Caspase-1水平聯合檢測預測患者預后的AUC為0.916,表明聯合檢測對并發SBP患者預后具有預測價值,提示或可將它們的監測應用于預測乙型肝炎肝硬化并發SBP患者的預后。

綜上所述,乙型肝炎肝硬化并發SBP患者存在PBMCs NLRP3和Caspase-1水平升高現象,且聯合檢測對患者預后具有預測價值。