棉花PAL基因家族的全基因組鑒定及其在逆境脅迫下的表達分析

王梓鈺，古麗斯坦·賽米，劉隋赟昊，黃耿青，張經博，郭彥君

（新疆師范大學 生命科學學院/新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

苯丙烷類物質代謝是研究最廣泛的代謝途徑之一，苯丙烷代謝物的生物合成和多樣性是通過一系列酶實現的[1-2]。苯丙烷代謝的前3個步驟是苯丙烷代謝的公共途徑，為下游代謝物提供前體，苯丙氨酸經苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸4-羥化酶、4-香豆酸輔連接酶一系列的酶催化后，最終生成4-香豆酸輔酶A，然后通過不同酶的催化作用進入下游合成途徑，即木質素途徑和類黃酮途徑，產生木質素、花青素、原花青素、黃酮類化合物、蘆丁等次級代謝產物[3-4]。

PAL作為苯丙烷類代謝途徑的起始酶，于1973年開始被研究[5]，現已從一些藻類、裸子植物、被子植物中分離得到了PAL基因[6-8]，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有4個[9]，楊樹（Populus trichocarpa）中有5個[10]，苜蓿（Medicago sativa） 中有7個[11]，西瓜（Citrullus lanatus） 中有12個[12]，馬鈴薯（Solanum tuberosum）中有14個[13]。PAL是連接初級代謝和次級代謝的“代謝樞紐”，它不僅在植物的正常生長發育中發揮重要作用，也是植物應答生物或非生物脅迫時的一種關鍵酶[14]。 羅勒草（Ocimum basilicum）中，ObPAL基因的表達量隨著干旱程度的加劇而逐步升高[15]。在冷脅迫下，芒草（Miscanthus sinensis）的耐冷株系中PAL活性顯著提高，這可能是因為耐冷株系對冷脅迫做出的應答[16]。當植物受到生物或非生物脅迫時，PAL活性常常與多酚、花青素、類黃酮等次生代謝物質的積累呈顯著正相關，煙草（Nicotiana tabacum）中PAL酶活性的增強可以提高木質素的含量，幫助植物抵御干旱脅迫[17]。玉米（Zea mays）苯丙氨酸解氨酶可能通過正向調節水楊酸的積累來抵抗甘蔗花葉病毒感染[18]，水稻過表達OsPAL8，促進水楊酸和木質素的生物合成和積累，顯著提高水稻對褐飛虱的抗性[19]；可見，PAL可以通過調節次級代謝產物的合成來增強植物的抗逆水平。

在一個物種中，PAL基因家族常常包含多個成員，表達分析顯示，PAL基因的表達常常具有時空特異性和組織特異性；當面臨不同脅迫時，不同PAL基因的表達量變化也往往不同[13]。因此，PAL基因可能具有不同的分工，想要利用PAL基因進行植物抗逆性改良，需要從多個角度對各個PAL基因進行分析研究。

棉花是當今全球主要的經濟作物之一，作為我國主要經濟作物和主要天然纖維來源，已成為我國除糧食以外不可缺少的戰略儲備物資[20]，但自然降水量不足、部分地區土壤鹽堿化嚴重、極端高溫天氣和“倒春寒”現象限制棉花產量和質量[21]。因此，解析棉花抗逆分子機制，將有助于我們通過遺傳育種的方式，培育高產抗逆的棉花新品種。

本研究對陸地棉、海島棉、草棉、雷蒙德氏棉中的 PAL基因進行了鑒定，分析了它們在不同棉種中的系統發育關系；對陸地棉PAL基因啟動子區的順式作用元件進行了分析，初步預測棉花中PAL可能參與的生物學過程；對陸地棉PAL基因的組織表達模式、在非生物或生物脅迫下的表達模式進行了分析，初步篩選出了一些可能參與棉花逆境脅迫應答的PAL基因，旨在了解PAL基因在棉花抗逆分子機制中的作用，為棉花遺傳育種提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 棉花 PAL 家族成員的鑒定

為了鑒定棉花中的PAL基因家族成員，首先從pfam3.0（http://pfam.xfam.org/）數據庫中下載PAL蛋白結構域的隱馬爾可夫模型（PF00221），并從棉花基因組數據庫（https://yanglab.hzau.edu.cn/CottonMD）下載陸地棉、海島棉、草棉和雷蒙德氏棉的基因組序列和蛋白質序列，所用版本依次為TM1_WHU、H7124_ZJU、A1_WHU、D5_HAU。而后利用HMMER 3.0軟件以PAL蛋白結構域的隱馬爾可夫模型為模板，搜索鑒定棉花中的PAL基因家族成員。利用TBtools軟件對棉花PAL蛋白質的分子質量、等電點和氨基酸數量等基本理化性質進行分析。使用WoLF PSORT（http://wolfpsort.seq.cbrc.jp）對棉花PAL蛋白的亞細胞定位情況進行預測。

1.2 棉花PAL基因家族系統進化分析

從phytozome數據庫（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和可可（Theobroma cacao）的PAL家族蛋白序列。利用MUSCLE對PAL蛋白序列進行多序列比對，使用最大似然法將比對結果輸入MEGA-x軟件構建系統進化樹，自展值（bootstrap value）設為1 000。使用Evolview（https://evolgenius.info//evolview-v2/#login）對進化樹進行美化。

1.3 棉花PAL染色體定位和共線性分析

從陸地棉、草棉和雷蒙德氏棉的基因組注釋文件中提取PAL基因成員的位置信息，利用Circos軟件繪制PAL基因在染色體上的位置。使用MCScanX軟件分析陸地棉PAL基因家族成員與草棉和雷蒙德氏棉PAL基因家族成員之間的共線性關系，而后利用Circos軟件對共線性分析結果進行可視化。

1.4 棉花PAL基因的結構和保守基序分析

將棉花PAL蛋白序列提交到MEME Suite 5.1.0在線軟件預測棉花PAL蛋白的保守基序，基序數量設定為20。從棉花數據庫（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下載基因組文件注釋文件，而后將基因組注釋文件輸入Tbtools軟件獲取PAL的基因結構信息。

1.5 棉花PAL 基因啟動子順式作用元件預測及分析

提取棉花PAL基因起始密碼子上游2 000 bp的序列作為啟動子序列，將獲取的序列提交到PlantCARE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數據庫，進行順式作用元件分析。對獲得的順式作用元件進行整理，將整理后的順式作用元件信息輸入Tbtools軟件進行可視化。

1.6 棉花PAL基因家族的表達模式分析

從棉花數據庫（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下載陸地棉各個組織、胚珠不同發育時期和纖維不同發育時期的轉錄組數據（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），將轉錄組數據進行標準化處理，用log2（TPM+1）代表每個基因的表達量，使用TBtools軟件繪制熱圖。從棉花數據庫（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下載陸地棉在干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫下的轉錄組數據（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），將轉錄組數據進行標準化處理，同時以處理組/對照組作為每個基因的相對表達量，而后利用TBtools軟件繪制熱圖。大麗輪枝菌處理棉花的轉錄組數據來源于NCBI SRA數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA745369），使用hisat 2軟件將轉錄組數據的reads比對到陸地棉基因組，利用stringtie軟件對轉錄本進行拼接，而后使用htseq軟件對轉錄本進行表達定量，從中提取棉花PAL基因的表達數據，并利用TBtools對表達數據進行可視化。

1.7 RNA提取及基因表達定量分析

對陸地棉新陸早64號3周齡的幼苗進行處理，以霍格蘭培養液水培組作為對照組，以NaHCO3水培組作為處理組。分別在處理0、1、3、6、12、24 h時，收集對照組和處理組的棉花葉片，利用植物RNA提取試劑盒（成都，福際生物）提取棉花葉片的RNA，而后用反轉錄試劑盒（成都，福際生物）將 RNA 反轉錄為 cDNA。使用PAL基因的特異性引物（表1），利用雙鏈嵌合熒光染料法（SYBR GreenⅠ）進行qPCR試驗，以GhHIS3作為內參基因，取3次生物學重復的平均值，采用2-ΔΔCt法計算基因的表達量，并以處理組/對照組作為每個基因的相對表達量。

表1 棉花PAL基因qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR of cotton PAL genes

2 結果與分析

2.1 棉花PAL基因家族的鑒定及序列分析

利用HMMER軟件搜索棉花基因組中的PAL基因家族成員，在陸地棉、海島棉、草棉、雷蒙德氏棉基因組中分別鑒定到15個GhPAL基因、13個GbPAL基因、7個GhePAL基因、8個GrPAL基因，根據它們在染色體上的位置進行命名（表2）。

表2 棉花PAL基因家族成員的基本信息Tab.2 The basic information of PAL family genes in cotton

理化性質分析顯示，棉花PAL蛋白的氨基酸數目為206～988個，蛋白分子質量為23 432.17～109 057.41 u，理論等電點為5.85～9.09。亞細胞定位預測分析顯示，大部分PAL蛋白定位在葉綠體，少數定位在細胞質和質膜（表2）。

使用在線網站MEME分析棉花PAL的蛋白保守基序，將預測到的20種基序命名為Motif 1～Motif 20。結果顯示，絕大多數 PAL蛋白基序組成較為相似，只有GhPAL10、GhPAL11、GbPAL10與其他PAL成員相比，缺少一些共有基序。PAL基因的結構分析結果顯示，PAL基因的外顯子數目為2～6個，同一分支的基因呈現相似的基因結構（圖1）。

圖1 棉花PAL基因家族的蛋白保守基序和基因結構分析Fig.1 Conserved motifs and gene structures analysis of PAL gene family in cotton

2.2 棉花PAL基因家族的系統進化分析

利用棉花、擬南芥、可可、水稻、玉米、二穗短柄草的PAL蛋白序列構建系統進化樹，結果顯示，PAL基因家族可以分為7個亞組。單子葉植物和雙子葉植物的PAL呈現出聚類分布的特征，即group1～group3中只有單子葉植物PAL家族成員的分布，而group4～group7中只有雙子葉植物PAL家族成員的分布。棉花PAL家族成員分布在group4、group6和group7亞組中，而group4只有棉花PAL家族成員的分布，說明棉花PAL家族在進化過程中產生了新的分化。此外還發現，group5中只有擬南芥PAL家族成員的分布，而group6和group7中除了有棉花PAL家族成員之外，還包含了可可PAL家族成員，說明棉花和可可PAL的親緣關系較近（圖2）。

圖2 棉花PAL基因家族的系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PAL gene family in cotton

2.3 棉花PAL基因家族的共線性分析

為進一步探索棉花PAL基因家族的進化關系，對陸地棉、草棉、雷蒙德氏棉PAL基因進行共線性分析，結果如圖3所示。

圖3 棉花PAL基因家族的共線性分析Fig.3 Collinearity analysis of PAL gene family in cotton

圖3結果表明，陸地棉A基因組的6個PAL基因與草棉6個PAL基因存在共線性關系，陸地棉D基因組的6個PAL基因與雷蒙德氏棉的6個PAL基因存在共線性關系。說明陸地棉PAL基因在進化時具有很大的保守性。另外，陸地棉GhPAL3、GhPAL10和GhPAL11與草棉或雷蒙德氏棉的PAL基因不存在共線性關系，說明它們是陸地棉形成后進化而來的基因。草棉GhePAL3與陸地棉PAL基因不存在共線性關系，雷蒙德氏棉GrPAL3、GrPAL8與陸地棉PAL基因不存在共線性關系，說明陸地棉PAL基因的進化過程中可能發生了基因丟失。

2.4 陸地棉 PAL基因啟動子上的順式作用元件分析

由于陸地棉是目前種植范圍最廣的棉花，因此，后續重點對陸地棉PAL基因進行了研究。首先，對15個陸地棉PAL基因啟動子上的順式作用元件進行了分析，共鑒定出22種元件，其中激素響應元件8種，分別為脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件GARE-motif、TATC-box，水楊酸響應元件TCA-element，茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif 和生長素響應元件TCA-box、TCA-element；脅迫相關的元件3種，包括低溫響應元件LTR，干旱響應元件MBS，防御應激元件TC-rich repeats；生長發育相關的元件6種，包括類黃酮生物合成元件MBSI，光響應元件chs-CMA1a、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif、G-box；除GhPAL3外，所有成員都含有光響應元件，GhPAL1和GhPAL11中的光響應元件數量最多（圖4）。基于進化樹的聚類分析顯示，一些親緣關系較近的GhPAL基因啟動子上順式作用元件的種類和位置具有一定的相似性，例如，GhPAL5和GhPAL13、GhPAL2和GhPAL9、GhPAL6和GhPAL14（圖4）。

圖4 陸地棉PAL基因啟動子上的順式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements on PAL gene promoters in Gossypium hirsutum

2.5 陸地棉PAL基因的組織表達模式分析

為探究陸地棉PAL基因在棉花生長發育過程中的生物學功能，利用已發表的陸地棉轉錄組數據分析了15個PAL基因在根、葉片、花萼、莖、花托、花藥、苞片、花絲、花瓣、雌蕊和不同發育時期的胚珠、棉纖維中的表達水平，其中棉花胚珠和纖維的發育時期用開花后天數（Days post anthesis，DPA）來描述，結果如圖5所示，很多位于同一進化枝的GhPAL基因具有相似的表達模式，例如，GhPAL2和GhPAL9、GhPAL6和GhPAL14、GhPAL4和GhPAL12、GhPAL1和GhPAL8，在以上所提到的組織中表達模式相似，說明這些基因對中的2個基因可能發揮類似的功能。有意思的是，位于同一進化枝的GhPAL13和GhPAL15在胚珠和纖維中的表達模式相似，在根、葉片、花萼、莖、花托、花藥、苞片、花絲、花瓣、雌蕊中的表達模式有差異，說明它們可能在胚珠和纖維發育過程中功能相似，而在根、葉片等組織中的功能有差異。

圖5 陸地棉PAL基因的組織表達分析Fig.5 Tissue expression analysis of PAL genes in Gossypium hirsutum

從表達量的角度看，GhPAL6和GhPAL14在根、莖、花絲和開花后15 d（15DPA）的胚珠中特異高表達，說明這2個基因可能在根、莖、花絲和15DPA胚珠的發育過程中發揮較大的作用。GhPAL1和GhPAL8在開花后10 d（10DPA）和15 d（15DPA）的胚珠中特異性高表達，說明它們可能在10DPA和15DPA的胚珠中發揮較大功能。此外，不同發育時期的胚珠中GhPAL的表達水平差異較大，開花前3 d（-3DPA）、開花當天（0DPA）、開花后1 d（1DPA）、3 d（3DPA）、5 d（5DPA）的胚珠中所有GhPAL均不表達，直到開花后10 d胚珠中才有GhPAL表達。

在棉纖維中，大部分PAL基因的表達量在纖維發育的各個時期均呈現較低的表達水平或者幾乎不表達，只有GhPAL1基因和GhPAL8基因在10 DPA和15 DPA纖維中表達量較高，這說明可能只有GhPAL1/GhPAL8參與了棉花纖維的發育過程。此外，注意到有3個基因GhPAL3、GhPAL10和GhPAL11在所分析的所有組織中表達量都很低。

2.6 陸地棉PAL基因在非生物逆境脅迫下的表達分析

為了進一步了解PAL基因是否參與了棉花對非生物脅迫的應答過程，利用轉錄組數據分析了PAL基因家族成員在PEG處理、NaCl處理、4 ℃處理、37 ℃處理所造成的4種非生物脅迫下的表達模式，并利用qPCR技術分析了PAL基因在NaHCO3處理模擬堿脅迫時的表達模式。圖6-A結果顯示，GhPAL4在PEG處理1 h發生顯著上調，GhPAL5、GhPAL12在PEG處理6 h發生顯著上調，還有多個PAL基因在PEG處理12 h發生上調，說明一些PAL基因參與了棉花對滲透脅迫的應答過程。聚類分析顯示，位于同一進化枝的GhPAL基因在對PEG處理的響應方面具有一定的相似性，例如，GhPAL13和GhPAL15、GhPAL2和GhPAL9、Gh-PAL6和GhPAL14、GhPAL1和GhPAL8在受到PEG處理后具有相似的表達模式，在相同處理時間后發生表達量的上調。但也有一個例外，GhPAL4和GhPAL12位于同一進化枝，受PEG誘導最為顯著，但GhPAL4是在PEG處理1 h表達量顯著上調隨后下降，而GhPAL12在PEG處理6 h時表達量顯著上調，說明GhPAL4和GhPAL12基因可能在應答滲透脅迫過程中發揮較大的作用，但二者發揮作用的時間不同，可能存在功能差異，通過協作來應答滲透脅迫。圖6-B結果顯示，GhPAL1、GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL6、GhPAL8、GhPAL9、GhPAL12、GhPAL13、GhPAL14、GhPAL15的表達量在NaCl處理不同時段發生上調，表明部分PAL基因與棉花應答鹽脅迫過程相關。其中，GhPAL4和GhPAL12受誘導程度最高，GhPAL4在NaCl處理1 h時表達量顯著上調，GhPAL12在NaCl處理6 h時表達量顯著上調，且能在NaCl處理12 h時繼續上調，說明二者可能在應答鹽脅迫過程中發揮較大功能。

圖6 PEG處理（A）、NaCl處理（B）、4 ℃低溫處理（C）和37 ℃高溫處理（D）后陸地棉PAL基因的表達分析Fig.6 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum after PEG treatment（A），NaCl treatment（B），low temperature treatment at 4 °C（C）， and high temperature treatment at 37 °C（D）

圖6-C結果顯示，GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL7、GhPAL15的表達量在4 ℃低溫處理后的不同時段發生上調，說明部分PAL基因的表達受低溫脅迫的誘導，其中GhPAL7受誘導程度最高。圖6-D結果顯示，GhPAL4、GhPAL5、GhPAL7、GhPAL12的表達量在37 ℃高溫處理后的不同時段發生上調，表明部分PAL基因的表達受高溫脅迫的誘導，其中，GhPAL7受誘導程度最高。說明GhPAL7既可以應答低溫脅迫，又可以應答高溫脅迫，此外，GhPAL7在4 ℃低溫或37 ℃高溫處理1 h時表達量即顯著升高，說明其應答較為迅速。在37 ℃高溫處理時，除了GhPAL7以外，GhPAL4和GhPAL12的表達上調程度也較高。與PEG處理和NaCl處理相似的是，GhPAL4和GhPAL12也是在處理的不同時間表達上調，即GhPAL4在37 ℃處理1 h、GhPAL12在37 ℃處理6 h時表達上調。

利用qPCR技術分析GhPAL在NaHCO3處理模擬堿脅迫時的表達模式，將qPCR結果用熱圖展示，基于進化關系進行聚類，結果如圖7所示，15個GhPAL基因均能夠對NaHCO3處理作出響應，在處理后的不同時間發生表達上調，表明PAL基因參與了棉花對堿脅迫的應答。其中，GhPAL6和GhPAL15上調程度高于其他基因，說明二者在應答堿脅迫時可能發揮較大的功能。聚類分析結果顯示，同一進化枝上的GhPAL應答堿脅迫時并沒有表達模式上的相似性。

圖7 堿脅迫下陸地棉PAL基因的表達分析Fig.7 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum under alkali stress

2.7 陸地棉PAL基因在生物脅迫下的表達分析

為了研究PAL基因能否對大麗輪枝菌的侵染作出響應，利用大麗輪枝菌處理棉花的轉錄組數據[22]，對PAL基因的表達模式進行了分析，結果如圖8所示，GhPAL1、GhPAL5、GhPAL12、GhPAL13的表達量在處理72、120 h發生顯著上調，且在大麗輪枝菌耐受性棉花品種中棉2和敏感性品種新陸早36中均可發生顯著上調，說明這些PAL基因可能參與棉花對黃萎病的抵御過程。GhPAL3、GhPAL4、GhPAL8、GhPAL12、GhPAL14和Gh-PAL15的表達水平在大麗輪枝菌處理條件下未發生明顯的改變。位于同一進化枝的A亞基因組和D亞基因組的GhPAL同源基因在受到大麗輪枝菌侵染后的表達量差異較大，例如，GhPAL1在處理72、120 h時表達上調，而GhPAL8的表達量雖然較高，但在處理前后并無顯著變化，說明PAL基因在應答大麗輪枝菌侵染方面可能存在功能分化。

圖8 受到大麗輪枝菌侵染后陸地棉PAL基因的表達分析Fig.8 Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum after infection by Verticillium dahliae

3 結論與討論

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷途徑中的一種關鍵酶，該家族基因已有部分成員的功能在擬南芥[9]、玉米[18]、水稻[23]等植物中被挖掘，但棉花PAL的研究仍然較少。近年來，棉花基因組數據的不斷更新使得我們可以更加準確地對棉花各類基因家族進行鑒定，棉花的進化起源問題也得到進一步解析。陸地棉是由A亞基因組和D亞基因組構成的異源四倍體，草棉和亞洲棉是由A亞基因組構成的二倍體。研究發現，陸地棉、草棉和亞洲棉的A亞基因組At、A1和A2均起源于一個已經消失的基因組A0，而從進化關系上看，草棉的A1基因組比亞洲棉的A2基因組更接近于祖先A0基因組[24]，因此，這里選擇草棉的基因組用于分析。本研究利用生物信息學方法，從陸地棉、海島棉、草棉和雷蒙德氏棉中分別篩選到了15、13、7、8個PAL基因，其中從陸地棉中篩選出的PAL基因比李雨哲等[25]報道的多3個，這可能是由于本研究所使用的基因組數據更加完善的結果。這4種棉花中PAL基因數目不同，陸地棉和海島棉的PAL基因數目約是草棉和雷蒙德氏棉的2倍，其原因一方面是由于草棉和雷蒙德氏棉為二倍體，陸地棉和海島棉是由A、D亞基因組形成的四倍體；另一方面是由于這4種棉花在進化過程中可能發生基因的擴張或丟失。這43個棉花PAL基因的蛋白保守基序十分相似，基因結構中外顯子數目大多為2個，這與許多植物（如馬鈴薯[13]、葡萄[26]、小麥[27]）中PAL基因家族分析的結果一致。系統進化分析顯示，棉花PAL與可可的親緣關系較近。

順式作用元件在PAL基因發揮功能的過程中起重要作用，例如，擬南芥MYB15可以結合PAL1啟動子上的AC元件，促進G-木質素的合成，增強擬南芥的基礎免疫能力[28]。水稻中，OsMYB30可以通過結合OsPAL6和OsPAL8啟動子上的AC-rich元件，提高OsPAL6和OsPAL8的表達量，增強水稻對褐飛虱的抗性[19]。這里，許多陸地棉PAL基因的啟動子上存在重要的激素響應元件和脅迫應答元件。茉莉酸甲酯響應元件TGACG-Motif、CGTCA-Motif在陸地棉PAL基因的啟動子上廣泛分布，占順式作用元件總數的28%；此外，數目較多的元件有水楊酸響應元件TCA-element（占比為8%）和干旱響應元件MBS（占比為6%）。陸地棉PAL啟動子上如此之多的激素響應元件和脅迫應答元件說明這些基因可能在激素信號轉導和逆境脅迫中發揮作用。另外，單個PAL基因的啟動子上不只含有1種激素或脅迫響應元件，例如，在各組織中表達量較高的GhPAL14啟動子上既含有水楊酸響應元件，又含有茉莉酸甲酯響應元件，說明一個PAL基因可能參與多種應答過程。結合逆境脅迫下的表達分析結果，發現PAL基因啟動子上的順式作用元件與相應脅迫具有一定的相關性。例如，GhPAL2、GhPAL4、GhPAL6、GhPAL7、GhPAL8、GhPAL9的啟動子上含有干旱響應元件MBS，它們在PEG處理模擬干旱脅迫后的不同時間均發生了表達量上調；GhPAL5和GhPAL15的啟動子上含有低溫應答元件LTR，二者在4 ℃低溫脅迫時表達量明顯上調。

PAL基因家族在植物的生長發育過程中發揮著重要的作用[4]。在煙草中抑制PAL基因的表達，改變了花的形態和顏色，并導致花粉活力降低[29]。突變AtPAL1和AtPAL2使擬南芥的花粉活力降低，從而導致擬南芥的育性下降[30]。棉花中，多個PAL基因在花藥、花瓣和花絲中優勢表達，暗示棉花PAL基因可能與煙草、擬南芥的PAL基因具有相似的功能。三尖杉（Cephalotaxus fortunei）的PAL基因主要在根和莖葉中高表達，棉花中共有9個PAL基因在根和莖中高量表達，表明PAL基因參與了植物的根和莖的發育過程[31]。棉花的PAL基因還在開花后10、15 d胚珠中優勢表達，說明它們也參與胚珠的發育過程。此外本研究還發現，在同一種棉花組織中常常存在多個優勢表達的陸地棉PAL基因，說明PAL基因在這些組織的發育過程中可能存在功能冗余現象。

在擬南芥中過表達暗紫貝母FuPAL1和大豆GmPAL1.1增強對干旱脅迫的耐受性[32-33]，馬鈴薯在38 ℃處理條件下StPAL8和StPAL12顯著上調[13]。本研究發現，在PEG及NaCl處理條件下，GhPAL4和GhPAL12的表達顯著上調，預測這2個基因可能正調控棉花抗旱；37 ℃處理條件下，GhPAL7、GhPAL4和GhPAL12顯著上調，說明它們可能參與棉花對高溫脅迫的應答過程。進一步的NaHCO3鹽堿脅迫模擬發現，所有GhPAL基因的表達均在NaHCO3處理條件下發生上調，這也進一步證實了PAL基因參與植物對鹽和堿脅迫的應答過程。而PAL基因對生物脅迫的應答，發現GhPAL1/GhPAL5/GhPAL12/GhPAL13的表達量在大麗輪枝菌侵染后發生上調。ZHAN等[34]和CASS等[35]研究發現，PAL基因參與了植物對生物脅迫的應答過程，不同在于抑制小麥TaPAL32和TaPAL42的表達降低了其抗條銹病；而敲降二穗短柄草BdPAL基因可提高對鐮刀真菌的敏感性。這與本研究結果一致。

本研究利用生物信息學方法從4個棉種中鑒定出了43個PAL基因家族成員，其中，陸地棉含有15個。通過分析陸地棉PAL家族基因的啟動子順式作用元件和誘導表達模式發現，陸地棉大多數PAL基因均具有脅迫響應相關元件，并且一些GhPAL可在不同程度上受滲透脅迫、鹽脅迫、堿脅迫、低溫、高溫等非生物脅迫的誘導，且受大麗輪枝菌生物脅迫的誘導。其中，GhPAL4和GhPAL12這對同源基因，其啟動子上含有脅迫響應元件，且在滲透脅迫、鹽脅迫、高溫脅迫時表現出較高的表達量，但其響應時間不同，因此，推測這2個基因可能通過部分功能分化協同應答多種非生物脅迫。GhPAL1、GhPAL5和GhPAL13的表達在大麗輪枝菌處理條件下發生顯著上調，推測它們可能參與棉花對黃萎病的抵御過程。這些基因為進一步解析PAL基因家族響應脅迫的潛在功能提供了參考，但后續仍需要試驗證據對這些PAL的功能進行解析。