肉桂精油脂質體的制備及理化性質研究

涂倩,簡玉英,謝大明,曾珍,劉韞滔,王彩霞,胡濱,李誠

(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625000)

肉桂精油是從肉桂葉和樹皮中提取的次級代謝產物,呈黃色黏性狀,含有肉桂醛、香芹酚、香葉醇、芳樟醇及α-水芹烯等一系列活性物質,具有抑菌、抗氧化、消炎鎮痛、抑制癌細胞生長繁殖等多種生理功能[1]。肉桂精油作為一種天然防腐劑,對食源性致病菌和腐敗菌(大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌等)的生長表現出良好的抑制作用,此外,精油中的烯萜類、醛類等活性成分亦賦予其較強的抗氧化活性[2]。然而,肉桂精油穩定性和水溶性差、對環境敏感以及伴有強烈的氣味,限制了其應用范圍[3]。

脂質體是由磷脂分子在水溶性中形成具有雙分子層結構的閉合囊泡,可同時包裹疏水性和親水性物質,具有生物相容性、兩親性、緩釋等優點,在食品、醫藥、化妝品等領域有重要應用前景[4]。作為一種運載體系,脂質體不僅可增強被包封物質的穩定性,還可延長活性物質在體內的保留時間,達到緩釋作用。將精油制備成脂質體這一載體形式,不僅可有效降低環境因素(如氧氣、光、溫度等)對肉桂精油的不利影響,還可掩蓋精油的刺激性氣味,提高感官屬性和精油的生物利用度。

近年來,隨著研究的不斷深入,學者們對精油脂質體的研究逐步展開。例如,劉玉蘭[5]采用乙醇注入法制備了肉桂醛脂質體,通過考察保留率、粒徑等理化指標,證明了脂質體的穩定性。李偉[6]通過薄膜超聲分散法將肉桂精油/β-環糊精包合物包封于脂質體內,再通過凍融方法制得包埋肉桂精油/β-環糊精的蛋白脂質體,通過體外釋放證實了蛋白脂質體運載體系具有控釋抗菌作用。高壓微射流均質技術制備的脂質體具有粒徑小、分散均勻且避免使用有毒試劑的特點,但目前關于采用該技術優化制備肉桂精油脂質體的報道尚未出現。鑒于此,本研究采用薄膜分散-高壓均質法制備肉桂精油脂質體,以包埋率和平均粒徑為指標對制備工藝進行優化,并對其zeta電位、形貌、熱穩定性、紅外光譜、體外釋放及抑菌性能等理化性質進行考察。研究旨在開發一種包埋率較高、穩定性好、緩釋效果好的脂質體運載體系,以擴大肉桂精油的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油(純度85%),上海源葉有限公司;蛋黃卵磷脂(純度90%)、膽固醇(純度95%)、吐溫-80,上海生工生物工程股份有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2),北京索萊寶科技有限公司;大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538),嘉楚生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設備

Nano-ZS馬爾文分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;3001-2207酶標儀,美國賽默飛有限公司;AH-BASIC高壓均質機,安拓思納米技術有限公司;RCD-1A高速均質機,常州越新儀器制造有限公司;Nicolet IS 10傅里葉紅外色譜儀,賽默飛世爾科技有限公司;Q200MDSC差示掃描量熱儀,美國TA公司;59750氣相質譜聯用儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肉桂精油脂質體的制備

將一定比例的蛋黃卵磷脂、膽固醇、吐溫-80、肉桂精油溶于25 mL無水乙醇中,溶解混勻后轉移至圓底燒瓶中,置旋轉蒸發儀上減壓蒸發(45 ℃,40 r/min),除去有機溶劑,形成脂質薄膜,再加入PBS超聲水化得到懸濁液,然后利用高速分散機在10 000 r/min下剪切2 min,最后在60 MPa高壓均質下循環3～4次得到肉桂精油脂質體。

1.3.2 單因素試驗設計

分別探究:(1)在膽固醇與肉桂精油、吐溫-80質量比為1∶1∶1的條件下,磷脂與膽固醇質量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1);(2)在磷脂與膽固醇、吐溫-80質量比為4∶1∶1的條件下,肉桂精油質量濃度(1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL);(3)在磷脂與膽固醇、精油質量比為4∶1∶1條件下,吐溫-80質量濃度(1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL);(4)在磷脂與膽固醇、精油、吐溫-80質量比為4∶1∶1∶1的條件下,PBS用量(20、30、40、50、60、70 mL)對肉桂精油脂質體平均粒徑和包埋率的影響。單因素試驗優化某一參數時,分別固定磷脂與膽固醇質量比4∶1(磷脂質量濃度為10 mg/mL,膽固醇質量濃度為2.5 mg/mL),肉桂精油質量濃度2.5 mg/mL,吐溫-80質量濃度2.5 mg/mL,PBS用量40 mL。

1.3.3 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果,篩選出磷脂與膽固醇質量比(A)、肉桂精油質量濃度(B)、吐溫-80質量濃度(C)作為考察對象,包埋率(Y)為因變量,利用Box-Behnken設計對肉桂精油脂質體的制備工藝參數進行優化,試驗因素及編號見表1。

表1 試驗因素水平表Table 1 Table of test factor levels

1.3.4 肉桂精油脂質體理化性質的表征

1.3.4.1 肉桂精油包埋率的測定

肉桂精油標準曲線的制備:精密稱取肉桂精油100 mg置100 mL容量瓶中,無水乙醇稀釋定容制得1 mg/mL母液。取母液分別配制100、80、60、40、20、10 μg/mL系列溶液,以無水乙醇為空白參比,在290 nm波長下測吸光度,計算得到標準曲線為:y=0.008 4x+0.066 7,R2=0.998 4,該范圍內線性較好。

參考李暢等[7]的方法稍作修改,取1 mL脂質體于10 mL的離心管中,加4 mL石油醚,渦旋混勻后離心(6 000 r/min,10 min),收集上清液,重復操作2次后合并有機相,無水乙醇定容至25 mL,在290 nm處測定吸光度,按上述標準曲線計算游離精油含量A1。另取1 mL脂質體,用無水乙醇稀釋定容至25 mL,水浴超聲1 h,測定吸光度值并計算肉桂精油總含量A2,按公式(1)得出包封率:

(1)

式中:EE,肉桂精油包埋率,%;A1,游離肉桂精油含量,mg;A2,肉桂精油總含量,mg。

1.3.4.2 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)

參考CHAVES等[8]的方法,將少量肉桂精油脂質體滴加于100目銅網上,自然風干后用10 g/L磷鎢酸進行負染,晾干后進行TEM分析。

1.3.4.3 粒徑、聚合物分散性指數(polymer dispersity index,PDI)及zeta電位的測定

參考郝靜梅等[9]的方法,樣品用超純水稀釋100倍后,采用馬爾文分析儀測定其平均粒徑、PDI及zeta電位。

1.3.4.4 差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry,DSC)

參考顧家毓等[10]的方法,取5 mg經干燥的樣品置于坩堝中,以空白坩堝為對照,N2為載氣,10 ℃/min速度從25 ℃加熱至100 ℃,研究分析脂質體的熱至相變情況。

1.3.4.5 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)

參考ZHANG等[11]的方法,將樣品與KBr混勻壓片后,在4 000～500 cm-1紅外波段內對肉桂精油、肉桂精油脂質體進行光譜分析。

1.3.4.6 體外釋放分析

采用透析法[12]進行,取2 mL脂質體于透析袋(14 ku)中,置于100 mL PBS中并在25 ℃下連續振蕩(200 r/min),分別在0.5、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h定時取樣,同時補充等量緩沖液,在290 nm處測定吸光度,計算肉桂精油累計釋放量,并對體外釋放結果進行動力學擬合分析。

1.3.4.7 肉桂精油脂質體抑菌性能分析

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后,加7.5 g/L生理鹽水稀釋菌懸液,分別取4 mL肉桂精油脂質體和10 g/L吐溫-80稀釋的肉桂精油溶液于不同菌懸液中,體積分數為40%,37 ℃振蕩培養,每隔1 d取樣進行菌落計數。

1.3.5 數據處理與分析

采用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面設計與分析,Origin 2018進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蛋黃卵磷脂與膽固醇質量比

膽固醇是類脂質的主要成分,常作為脂質體的穩定劑[13],在適宜的濃度下,親水性羥基基團與磷脂分子極性基團形成氫鍵,利用氫鍵間相互作用來調解脂膜的剛性和致密性,能極大地穩定脂質體結構,進而穩定脂質體的負載能力。圖1-a結果顯示,隨著磷脂與膽固醇質量比的增大,包埋率顯著增加后降低,平均粒徑先減小后增加,當質量比為4∶1時,包埋率達最大(76.23%),平均粒徑最小(91.18 nm)。脂質體的濃度與其負載能力均會影響精油的包埋率,當磷脂與膽固醇質量比增加時,形成的脂質體分子增多且平均粒徑逐漸減小,結構逐漸趨于穩定,導致包埋率顯著增大。當質量比大于4∶1后,包埋率反而呈下降趨勢,且平均粒徑逐漸增大,這是由于磷脂濃度過高影響了脂質體膜的形成,降低了脂質體電荷之間的靜電排斥作用,聚集現象出現導致粒徑增大[14],此時的脂質體濃度高但體系不穩定,精油泄露,負載能力顯著減弱,致使包埋率降低。本試驗研究結果與前人研究結果相似[15]。綜合考慮確定磷脂與膽固醇的最佳質量比為4∶1,此時包埋率最大、粒徑最小、負載能力較好。

a-磷脂與膽固醇質量比;b-肉桂精油質量濃度;c-吐溫-80質量濃度;d-PBS用量圖1 磷脂與膽固醇質量比、肉桂精油質量濃度、吐溫-80質量濃度和PBS用量對肉桂精油脂質體包埋率、平均粒徑的影響Fig.1 Effects of mass ratio of phospholipid to cholesterol, mass concentration of cinnamon essential oil, mass concentration of tween 80 and PBS dosage on the embedding efficiency and average particle size of cinnamon essential oil liposomes

2.1.2 肉桂精油質量濃度

圖1-b結果表明,肉桂精油質量濃度從1 mg/mL增加到2.5 mg/mL,包埋率從62.48%增加到最大(81.26%),當精油質量濃度超過2.5 mg/mL時,包埋率逐漸降低,證明肉桂精油濃度過低或過高均不利于精油脂質體的形成,同時磷脂形成的脂質體具有一定的空間承載能力[16]。當肉桂精油濃度較低時,包埋率偏低,這可能是精油在低濃度下與脂質體體系接觸機率較少所致;隨著肉桂精油添加量增多,接觸機率增加,包埋率隨之增加;當添加量超過脂質體的負載能力時,再添加更多肉桂精油,亦不能被包埋于脂質體,最終導致包埋率降低。而平均粒徑隨肉桂精油濃度的增加先降低后逐漸增大,當肉桂精油為2 mg/mL時,粒徑最小為87.17 nm,出現此現象的原因是精油添加量超出了脂質體空間負荷,干擾磷脂間相互作用力,導致磷脂雙分子層結構的柔韌性和致密性減弱,致使雙分子層膨脹,粒徑增大[17]。綜合分析,選擇肉桂精油質量濃度為2.5 mg/mL較為理想,此時包埋率最大,粒徑相對較小。

2.1.3 吐溫-80質量濃度

由圖1-c可知,隨著吐溫-80質量濃度增加平均粒徑呈持續下降趨勢,包埋率先增大后減小,當吐溫-80質量濃度為2.5 mg/mL時,包埋率達最大(79.74%),而當濃度繼續增加,包埋率減小。吐溫-80是一種呈親水性長鏈結構的化合物,通過物理吸附在脂質體膜表面形成一定厚度親水層,具有空間位阻效應,使得脂質體系統牢固[18];然而過量的吐溫-80的加入導致乳化過度,脂質體囊泡被溶解,平均粒徑降低,同時造成脂質體內空間受限,不能對肉桂精油進行有效包埋[19]。綜合考慮,選擇吐溫-80質量濃度為2.5 mg/mL進行后續試驗。

2.1.4 PBS緩沖液用量

由圖1-d可知,平均粒徑先降低隨后趨于平穩且變化幅度較小,隨著緩沖液用量的增加,脂質體體系濃度下降,粒子間更加均勻分布,使得平均粒徑減少直到趨于平穩[20]。肉桂精油脂質體包埋率隨緩沖液用量增加逐漸升高,但緩沖液用量超過40 mL,包埋率略有下降。但過少的PBS,不利于脂質的水化過程,易產生聚集絮凝,從而導致包埋率較低。同時調查發現,本試驗研究契合宋恭帥等[21]的研究結果。綜上,PBS的增加引起包埋率和平均粒徑的變化并不明顯,確定PBS最佳用量為40 mL。

2.2 響應面優化分析

利用Design-Expert軟件對包埋率與各因素間的關系進行回歸分析,響應面優化試驗結果見表2。通過回歸擬合得到多元回歸方程為:

表2 響應面優化試驗結果Table 2 Response surface optimization test results

Y=81.68+1.08A+3.53B+5.80C-2.57AB+0.55AC-4.58BC-9.82A2-8.24B2-6.21C2

根據表3的方程分析,模型具有極顯著性(P<0.000 1);失擬項不顯著(P>0.05);R2=0.993 2,可以解釋99.32%的總變化,說明該模型擬合情況好,具有統計學意義。

表3 響應面方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

此外,線性系數A及相互作用系數AB對Y有顯著影響(P<0.05),線性(B、C)、相互作用系數(BC)和二次項系數(A2、B2、C2)對結果達到極顯著水平(P<0.01)。根據分析結果,影響包埋率的因素主次為:吐溫80質量濃度>肉桂精油質量濃度>磷脂與膽固醇質量比。如表3所示,兩兩因素之間的相互作用大小依次為:BC>AB>AC。

根據模型試驗結果,預測肉桂精油脂質體制備的最佳工藝條件為:磷脂與膽固醇質量比為4.09∶1(磷脂質量濃度為10.23 mg/mL,膽固醇質量濃度為2.5 mg/mL)、肉桂精油質量濃度為2.46 mg/mL、吐溫80質量濃度為2.99 mg/mL,此時理論包埋率為83.01%。為驗證該模型的可靠性,通過3次重復試驗,得出的包埋率平均值為81.95%,相對誤差為1.28%,說明理論值與實際值較為符合。

2.3 肉桂精油脂質體的理化性質

2.3.1 微觀結構

如圖2所示,肉眼下肉桂精油脂質體呈均勻的淡黃色乳液,電鏡下肉桂精油脂質體呈亮色的單層囊泡,囊泡周邊均出現一層陰影,分布均勻,這與郭嘉斌等[22]制備的香葉木素脂質體形態結構相似。同時觀察到存在小囊泡向大囊泡融合的趨勢,可能是脂質體囊泡存在熟化行為[23],這使得體系更加穩定。

a-外觀;b-微觀形態圖2 肉桂精油脂質體的外觀及微觀形態Fig.2 Appearance and microscopic morphology of cinnamon essential oil liposomes

2.3.2 粒徑與zeta電位分析

粒徑和zeta電位是衡量脂質體膠體穩定性的重要指標。如圖3所示,肉桂精油脂質體粒徑和zeta電位圖均為正態分布,其平均粒徑為94.21 nm,屬于納米顆粒,與TEM所顯示的尺寸基本一致。但動態光散射(dynamic light scattering,DLS)獲得的脂質體粒徑值不是絕對的,而是表觀粒徑,這是因為粒徑與布朗運動有關[24]。PDI為0.133<0.3,體系分散均勻。張婷等[25]制得蛋清肽脂質體平均粒徑為(95.0±0.8) nm,PDI為0.210±0.009,與本結果相似。通常情況下納米顆粒的zeta電位絕對值大于30 mV時,被認為是穩定的,而本研究結果顯示脂質體乳液的zeta電位為-40.4 mV,說明脂質體表面帶負電荷,粒子間相互排斥,沒有絮凝的傾向,較穩定。

a-粒徑;b-zeta電位圖3 肉桂精油脂質體的粒徑和zeta電位Fig.3 Particle size and zeta potential of cinnamon essential oil liposomes

2.3.3 DSC分析

DSC分析可檢測脂質體的相變溫度和穩定性。當溫度升高時,脂質體膜出現層狀凝膠相、波動凝膠相和液晶相等狀態,其中從層狀凝膠態到波動凝膠態過程稱為預相變,波動凝膠態到液晶態過程稱為主相變。由圖4可知,空白脂質體在35.48和71.64 ℃處出現了凝膠態向液晶態的致熱相變,其中35.48 ℃為預相變。與空白脂質體相比,肉桂精油脂質體的相變溫度(32.85、67.51 ℃)分別降低了2.62、4.13 ℃,表明肉桂精油脂質體的熱穩定性降低,這是由于肉桂精油與脂質體的膜材蛋黃卵磷脂的非極性頭部之間發生了疏水相互作用,降低了雙分子層的致密性和剛性,使得相變溫度降低[26],也可能是肉桂精油中的晶體結構和大小發生變化形成精油-磷脂復合物所致[27]。

圖4 差示掃描量熱分析圖Fig.4 Differential scanning calorimetry analysis

2.3.4 FTIR分析

圖5 紅外光譜分析圖Fig.5 Infrared spectrum analysis

2.3.5 體外釋放分析

以PBS作為釋放介質,模擬作為抑菌劑應用場景下的釋放,探究肉桂精油脂質體的釋放性能,結果如圖6所示。肉桂精油脂質體在2、24、48、72 h時的累積釋放度分別為5.13%,50.56%,79.23%,81.24%,說明該脂質體可以有效控制和減緩精油釋放。然后采用零級方程、一級方程和Higuchi方程對體外釋放數據進行擬合,三者得到的擬合結果分別為Mt=1.207 5t+10.555 5(R2=0.896 9),Mt=92.462 6(1-e-0.034 6t)(R2=0.991 1),Mt=11.989 2t1/2-10.938 0(R2=0.972 8),結果顯示肉桂精油脂質體的體外釋放規律最符合一級動力學方程。

圖6 肉桂精油脂質體的累積釋放曲線Fig.6 Cumulative release curve of cinnamon essential oil liposomes

2.3.6 肉桂精油脂質體抑菌性能分析

圖7-a和圖7-b分別是肉桂精油和肉桂精油脂質體對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用結果。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液的初始濃度值為7.6×107lg CFU/mL。在第0天2種菌懸液濃度與初始濃度相比略有上升,這是由于兩種菌處于對數生長期所致。圖7-a顯示肉桂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。2 d后由于精油揮發,細菌數分別達到7.08×107和6.87×107lg CFU/mL,并持續增長。而由圖7-b可知,加入肉桂精油脂質體后,培養1 d后2種菌的菌落總數均顯著減少(P<0.05),并且菌落數隨著時間的延長呈顯著持續下降的趨勢,表明肉桂精油從肉桂精油脂質體中緩慢釋放出來,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出長效抑菌作用。此外,由于革蘭氏陽性菌具有特殊的細胞壁結構,觀察到肉桂精油脂質體對金黃色葡萄球菌的抗菌活性高于大腸桿菌。革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的細胞壁呈現多層結構,其中包括肽聚糖、脂蛋白、磷脂和脂多糖;而革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的細胞壁僅被肽聚糖層包圍[30],因此肉桂精油脂質體釋放的精油很容易穿過革蘭氏陽性菌細胞壁并與其內容物相互作用。

a-肉桂精油;b-肉桂精油脂質體圖7 肉桂精油和肉桂精油脂質體的抑菌性能Fig.7 Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and cinnamon essential oil liposomes

3 結論

本文以包埋率、平均粒徑為指標,采用單因素試驗和響應面法優化了肉桂精油脂質體的制備工藝。得到最佳工藝參數為:磷脂與膽固醇質量比4.09∶1(磷脂質量濃度為10.23 mg/mL,膽固醇質量濃度為2.5 mg/mL),肉桂精油質量濃度2.46 mg/mL,吐溫-80質量濃度2.99 mg/mL,PBS用量為40 mL(0.01 mol/L,pH 7.2)。在此條件下得到包埋率為81.95%,粒徑為94.21 nm,PDI為0.133,zeta電位為-40.4 mV的肉桂精油脂質體。透射電鏡結果表明其微觀結構呈囊泡狀,分布均勻。通過熱力學性質和紅外光譜分析證實肉桂精油成功包封在脂質體內。此外,體外釋放和抑菌性能研究表明肉桂精油脂質體具有控釋抗菌作用,能提高肉桂精油殺菌效果。本研究以肉桂精油為切入點,構建了脂質體運載體系,并對肉桂精油脂質體制備工藝關鍵參數及其理化性質進行研究,成功優化并建立了一種穩定、高效的制備肉桂精油脂質體技術,為肉桂精油脂質體在食品中的進一步開發利用提供技術參考。