基于發(fā)根農(nóng)桿菌的大豆CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶點(diǎn)可行性的快速檢測方法

羅可 王珞 劉輝

摘要 研究選取大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因?yàn)榘袠?biāo)，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建靶點(diǎn)的基因敲除載體，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599的特性侵染大豆植株，以獲取不定根，通過對(duì)不定根的DNA提取和PCR測序鑒定，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)前的序列峰圖平穩(wěn)且準(zhǔn)確，在靶點(diǎn)處開始出現(xiàn)雜亂的套峰，表明大豆FAD2-1A與FAD2-1B2個(gè)基因均被成功編輯。此方法操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期較短，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大豆中選擇靶點(diǎn)的可行性的快速鑒定，為研究大豆的FAD2基因功能和遺傳改良方面提供了新的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9；大豆；發(fā)根農(nóng)桿菌；基因編輯

中圖分類號(hào)：S565.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2023）07–0056-03

大豆是世界上主要的油料作物之一，能夠?yàn)槿祟惡蛣?dòng)物提供豐富的蛋白質(zhì)和油脂[1]。隨著大豆基因組測序工作的完成，以及基因組學(xué)、生物技術(shù)的快速發(fā)展，從基因?qū)用嫱ㄟ^分子育種從而培育新的大豆品種成為重要的研究方向。

基因組編輯技術(shù)又被稱為靶標(biāo)基因工程，它通過編輯特定的基因、敲除基因、引起特異位點(diǎn)突變等方式修飾基因，是研究植物基因功能的重要方法之一[2]。種子中的油脂和蛋白質(zhì)含量是油料作物大豆品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]，利用基因編輯技術(shù)對(duì)大豆相關(guān)基因進(jìn)行靶向修飾，通過研究大豆中油脂和蛋白質(zhì)合成途徑相關(guān)功能基因，可進(jìn)一步培育得到高油酸、高品質(zhì)的大豆。近年來，盡管基因組編輯技術(shù)在大豆中得到了迅速應(yīng)用，然而相對(duì)于水稻、擬南芥等植物的研究，大豆基因編輯技術(shù)的應(yīng)用仍處于發(fā)展緩慢階段。

CRISPR/Cas9技術(shù)在大豆的應(yīng)用有以下問題面臨解決：首先，適合大豆基因編輯技術(shù)的系統(tǒng)研究發(fā)展緩慢，大豆整體基因編輯效率維持在10%左右，與基因編輯效率達(dá)到80%的水稻等植物相比，存在著巨大差距[4]。不僅如此，大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率低會(huì)影響陽性編輯體的植物的獲得；目前大多都采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，雖該體系經(jīng)過改良和優(yōu)化，但遺傳轉(zhuǎn)化率仍不理想，也大大降低了基因編輯技術(shù)在大豆改良上的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，在遺傳轉(zhuǎn)化前驗(yàn)證基因功能編輯靶點(diǎn)的可行性顯得尤為重要。

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，屬于根瘤菌科[5]，在其侵染植株后，能夠誘導(dǎo)植株產(chǎn)生大量高度分支的不定根。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了用于敲除大豆基因的載體，并通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法使大豆產(chǎn)生不定根，以驗(yàn)證FAD2基因上編輯靶點(diǎn)的可行性，為大豆基因組編輯和基因功能的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

植物材料大豆品種為黑河43，基因編輯載體PBSE401與中間載體購自BIOSCI生物公司；大腸桿菌E.coli DH5α購自Biomed 生物公司，發(fā)根農(nóng)桿菌K599購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN生物公司）；Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ、T4 DNA Ligase購于New England Biolabs（NEB）有限公司；DNA提取試劑盒、引物合成及測序來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶點(diǎn)選擇 通過CRISPR靶點(diǎn)序列在線設(shè)計(jì)工具CRISPOR設(shè)計(jì)FAD2-1A、FAD2-1B基因的敲除靶點(diǎn)，該工具能夠在輸入序列中找出所有的CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)，基于GC含量與二級(jí)結(jié)構(gòu)最終選取靶點(diǎn)T3與T28設(shè)計(jì)sgRNA，sgRNA擴(kuò)增引物及鑒定引物詳見表1。

1.2.2 載體構(gòu)建 根據(jù)Geneious軟件設(shè)計(jì)的sgRNA序列，以PCBC載體為模板，擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系50 μL：5×Phanta Buffer 10 μL、dNTP 1 μL、FAD2-DT1-BsF 2 μL、FAD2-DT1-F0 0.5 μL、FAD2-DT2-BsR 0.5 μL、FAD2-DT2-R0 2 μL、Phanta 1μL、ddH2O 32 μL、共計(jì)50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 40 s、從第2步起循環(huán)35次、72 ℃ 5 min。將帶有T3、T28的 sgRNA的靶點(diǎn)片段最后進(jìn)行 Golden Gate 反應(yīng)，體系5 μL：PBSE401 2 μL、PCR回收片段1 μL、10×BSA 0.5 μL、T4 DNA Ligase Buffer 0.5 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL、BsaⅠ0.5 μL，共計(jì)5 μL。最后采用T7酶切檢測法，對(duì)靶點(diǎn)編輯情況進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化 本實(shí)驗(yàn)采用黑河43大豆材料，參考已有的大豆不定根誘導(dǎo)方法，利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599，通過注射誘導(dǎo)大豆不定根，發(fā)根后，使用試劑盒提取不定根樣品DNA，用引物對(duì)靶點(diǎn)附近的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行回收測序，以驗(yàn)證分析靶點(diǎn)處是否出現(xiàn)基因編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體的構(gòu)建

大豆的脂肪酸去飽和酶2（FAD2）決定了大豆油中單不飽和脂肪酸的水平，能夠催化單不飽和脂肪酸—油酸轉(zhuǎn)化為多不飽和脂肪酸—亞油酸。大豆FAD2基因家族由多個(gè)基因組成，其中FAD2-1A和FAD2-1B主要在發(fā)育的種子中表達(dá)，可能影響大豆油中的油酸水平。研究表明，F(xiàn)AD2-1A和FAD2-1B的敲除能夠顯著提升油酸含量，降低亞油酸含量[6]。FAD2-1A和FAD2-1B均只含2個(gè)外顯子，編碼388個(gè)氨基酸，其CDS序列同源性高達(dá)94.9%（圖1A）。

通過查找cDNA序列上的PAM位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：能夠共同靶向FAD2-1A和FAD2-1B的靶點(diǎn)有4個(gè)，基于GC含量與二級(jí)結(jié)構(gòu)篩選出2個(gè)合適的目標(biāo)靶點(diǎn)，均位于2號(hào)外顯子上，其中靶點(diǎn)T1的5＇端第一個(gè)堿基有所不同，而靶點(diǎn)T2則完全一致（圖1B）。

實(shí)驗(yàn)所用CRISPR/Cas9敲除體系為PBSE401雙元體系，通過將含2個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)元件連接至二元載體PBSE401，形成最終的敲除載體（圖1C）。

2.2 種苗生根觀察選取

將注射菌懸液后培育2周的大豆種苗從蛭石中取出，即可清晰地觀察到其在發(fā)根農(nóng)桿菌的作用下生長許多不定根，將長勢(shì)良好的根系剪下，利用DNA提取試劑盒提取大豆不定根（圖2）。

2.3 不定根編輯效率檢測

T7核酸內(nèi)切酶BsaⅠ能夠識(shí)別并切割不完全配對(duì)DNA、Holiday結(jié)構(gòu)或交叉DNA、異源雙鏈DNA、十字形結(jié)構(gòu)DNA，或者以更慢的速度切割雙鏈DNA。本實(shí)驗(yàn)利用T7核酸內(nèi)切酶BsaⅠ識(shí)別并切割不完全配對(duì)DNA的特性，將包含野生型和突變型2種類型的PCR突變雜合體產(chǎn)物進(jìn)行T7檢測切割，在退火復(fù)性后形成不完全匹配的序列，進(jìn)而用T7核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，編輯個(gè)體在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中呈現(xiàn)出與野生型不同的切割條帶（圖3）。

T7酶切結(jié)果表明：在7個(gè)不定根樣品中，F(xiàn)AD2-1A基因在1、2、3、4、6號(hào)中呈現(xiàn)編輯陽性，F(xiàn)AD2-1B基因在7個(gè)樣品中均呈現(xiàn)出編輯陽性，靶點(diǎn)編輯效率較高。基于上述結(jié)果，選取2號(hào)樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)前的序列峰圖平穩(wěn)且準(zhǔn)確，在靶點(diǎn)處開始出現(xiàn)雜亂的套峰，編輯類型主要為堿基替換，在FAD2-1A的T3靶點(diǎn)處存在小片段的缺失，表明2號(hào)樣品的FAD2-1A和FAD2-1B基因均被編輯（圖4）。測序結(jié)果與酶切結(jié)果一致，說明通過誘導(dǎo)大豆不定根介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)能夠體外檢測大豆敲除靶點(diǎn)的可行性與編輯效率。

3 討論

隨著生物技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，以及基因編輯技術(shù)的逐步深入與完善，其效率高、操作簡單、成本低等優(yōu)勢(shì)逐步顯現(xiàn)，逐漸成為農(nóng)作物功能基因組研究和農(nóng)藝性狀改良的有效工具。Li等[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向了大豆貯藏蛋白基因，培育出高蛋白大豆，為大豆育種工作提供了寶貴的新資源。2018年，Curtin等[8]利用基因編輯技術(shù)編輯了大豆參與小RNA加工的基因，獲得能對(duì)鹽脅迫和干旱進(jìn)行相應(yīng)的突變體植株。近幾年CRISPR/Cas9技術(shù)雖然在大豆上取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但依然面臨著不少的“瓶頸”。大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系周期長、效率低問題；同時(shí)大豆基因編輯還存在打靶效率低下、可用編輯基因較少等困境。因此，如何提高替換效率、降低脫靶效率，提升遺傳穩(wěn)定性成為大豆在基因編輯領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

綜上，在大豆進(jìn)行基因編輯和遺傳轉(zhuǎn)化前，對(duì)于基因編輯靶點(diǎn)的可行性檢測顯得十分重要。利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆植物子葉外植體產(chǎn)生不定根，并提取不定根DNA以檢測基因編輯靶點(diǎn)效率的方法，具有操作簡單、試驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)。利用此方法可快速測定基因編輯靶點(diǎn)的可行性，避免在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

在本試驗(yàn)中，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了靶點(diǎn)敲除載體，以敲除大豆基因FAD2-1A和FAD2-1B基因，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)大豆植株產(chǎn)生不定根。通過對(duì)不定根DNA的提取和PCR擴(kuò)增測序，結(jié)果表明：編輯載體構(gòu)建成功，并成功對(duì)基因FAD2-1A和FAD2-1B進(jìn)行了編輯，證明該靶點(diǎn)可靠、有效，可用于對(duì)大豆植株基因編輯和遺傳轉(zhuǎn)化。

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A Rapid Detection Method for the Feasibility of Soybean CRISPR/Cas9 System Targets Based on Agrobacterium rhizogenes

Luo Ke et al（Biotechnology Research Institute， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Guizhou Province， Guiyang， Guizhou 550009）

Abstract The CRISPR/Cas9 gene editing method was used in this study to create gene knockout vectors for the soybean FAD2-1A and FAD2-1B genes. Agrobacterium rhizogenes K599 was then used to infect soybean plants and produce adventitious roots. The adventitious roots DNA was extracted， and PCR sequencing revealed that the adventitious roots sequence peaks were smooth and accurate before the target， and chaotic overlaid peaks started to develop near the target， showing that the soybeans FAD2-1A and FAD2-1B genes had been successfully altered. This approach offered novel technical assistance for the investigation of the FAD2 gene function and genetic advancement in soybeans. It was straight forward to use， has a brief experimental cycle， and enables rapid identification of the viability of target selection in soybeans.

Key words CRISPR/Cas9; Soybean; Agrobacterium rhizogenes; Gene editing