沙棘果油對超抗原誘導的特應性皮炎小鼠激素抵抗的干預作用及機制Δ

王欣欣 ，陳小艷 ，李思佳 ，張文蓮 ，王 昆 ，竇德強 （1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院，內蒙古 包頭 01060；.應急總醫院病理科，北京 10008；.遼寧中醫藥大學中醫學院，沈陽 11087；5.包頭醫學院第一附屬醫院病理科，內蒙古 包頭 01010）

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是兒童常見的皮膚炎癥性疾病，病情遷延，容易復發。在全球范圍內，AD 的發病率均表現出逐年上升的趨勢[1—2]。針對我國兒童和青少年群體進行的第3次全國范圍內流行病學調查顯示，AD患病率已從1998年的0.69%上升到2014年的12.94%[3]。多國治療指南均推薦外用糖皮質激素（glucocorticoid，GC）為AD局部治療的一線藥物[4—5]。然而，一些患者在外用GC治療時，隨著治療時間延長會出現激素抵抗，影響治療效果[6]。因此，尋找安全有效的替代或補充治療方法，干預AD 治療時的激素抵抗具有重要的公共衛生意義。超抗原（superantigen，SAg）是一類來源于細菌或病毒的蛋白質，其不需要抗原呈遞細胞加工，可以直接高效地激活免疫細胞[7]。且有研究表明，AD 患者皮損局部異常定植的金黃色葡萄球菌產生的SAg參與了激素抵抗的發生[8—9]。

中藥沙棘是植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果實，自古就被蒙醫、藏醫及中醫用于皮膚疾病的治療。沙棘果油是從沙棘果實中提取的重要生物活性物質，具有抗炎、抗氧化、免疫調節等作用[10—11]。本課題組前期研究發現，沙棘果油可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路調節AD小鼠的免疫應答，改善Th1/Th2失衡，回調皮損局部皮膚屏障功能的蛋白表達，修復皮膚屏障[12]。本研究擬在前期研究的基礎上，利用AD 模型深入分析沙棘果油對SAg誘導的小鼠AD激素抵抗的干預作用及相關機制，為從天然產物中尋找AD 激素抵抗的干預措施提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要包括：ASP6025型全自動組織脫水機、EG1150H eagle 型包埋機、RM2235 型組織切片機（德國Leica公司），BSZY23S-Y型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），2800UV/VIS型紫外分光光度儀[尤尼柯（上海）儀器有限公司]，Biofuge primo R 型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ESP200型電泳儀、4200SF型凝膠成像分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

沙棘果油（批號GR-134-161229）購自遼寧東寧生物藥業有限公司，主要成分為脂肪酸（主要包括油酸33.10%、棕櫚油酸27.52%、軟脂酸26.87%）、谷甾醇和β-胡蘿卜素；2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB，批號BCCC2721，純度≥99%）購自美國Sigma公司；地塞米松片（批號200311，規格0.75 mg/片）購自廣東南國藥業有限公司；兔源糖皮質激素受體α（glucocorticoid receptor alpha，GRα）抗體、兔源GRβ 抗體、兔源G蛋白抑制性α 亞單位1（G protein inhibitory subunit 1，Gαi1）抗體、兔源Gαi3 抗體、兔源核糖體蛋白S6 激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）抗體、兔源磷酸化S6K1（phosphorylated S6K1，p-S6K1）抗體、兔源蛋白激酶B1/2（protein kinase B，AKT1/2）抗體、兔源磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號分別為ab2768、ab233165、ab3580、ab23315、ab32529、ab59208、ab300473、ab38449、ab8245）均購自英國Abcam 公司；FITC 標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（批號GB22303）購自武漢塞爾維生物科技有限公司；IgE、白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為SEA545 Mu、SEA077Mu）均購自武漢云克隆科技股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL 化學發光試劑盒（批號分別為P0012S、P0018S）均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重（20±2） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。小鼠購入后飼養于SPF級標準動物室內，室內溫度為（24±2） ℃，相對濕度為（50±10）%，保持晝夜節律交替。飼養期間食用標準飼料，常規適應性飼養7 d。本實驗方案已通過包頭醫學院動物倫理委員會批準（批準號為2022第59號）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

將50只小鼠按照隨機數字表法分為5組，即正常對照組（A組）、模型組（B組）、地塞米松干預組（陽性對照，C組）、沙棘果油干預組（D組）、地塞米松+沙棘果油干預組（E 組），每組10 只。除A 組外，其余各組均采用DNCB+葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）法制備AD小鼠模型。具體造模方法是在文獻[12]的基礎上改進的：實驗第1天，給所有小鼠背部皮膚做除毛處理（除毛面積約2 cm×3 cm）；于實驗第1、3、5 天，使用2.5%SEB 溶液（20 μL）、1%DNCB 溶液（200 μL）涂抹于B、C、D、E組小鼠背部皮膚，每天1次，共3次；自實驗第7 天起，使用2.5%SEB 溶液（20 μL）、0.5%DNCB 溶液（20 μL）涂抹于B、C、D、E 組小鼠左耳部皮膚處進行激發，每3 天激發1 次，共10 次。自實驗第7 天起，分別使用地塞米松（1.5 mg/kg，劑量根據文獻[13]設置）和/或沙棘果油（10 mL/kg）[12]對C、D、E組小鼠進行灌胃，每天1次，連續28 d。實驗第35天，麻醉取血后處死小鼠（取血處死前，肉眼觀察所有小鼠左耳部皮膚外觀），取各組小鼠眼眶血，在4 ℃下以4 000×g離心10 min，取上清置于－80 ℃冰箱中凍存。

2.2 病理組織學觀察

取部分小鼠左耳部皮膚組織，用4%多聚甲醛固定，經脫水、透明、浸蠟等常規步驟處理后，制作蠟塊并切片（厚度為5 μm）。常規行蘇木素-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察各組小鼠左耳部皮膚組織形態特點，并測量各組小鼠左耳部皮膚表皮層厚度。

2.3 血清中IgE、IL-4水平的檢測

采用ELISA 法檢測。取“2.1”項下凍存血清，常規解凍處理后，按相應試劑盒說明書方法操作，檢測各組小鼠血清中IgE、IL-4水平。

2.4 耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達的檢測

2.4.1 耳部皮膚組織中GRα、GRβ陽性細胞數檢測

采用免疫熒光單標法檢測。取小鼠左耳部皮膚組織，放入4%多聚甲醛中固定8 h，經脫水、透明、浸蠟等常規步驟處理后，制作石蠟切片（厚度為5 μm），經二甲苯及梯度乙醇脫蠟、抗原修復后，以5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉1 h，分別滴加GRα、GRβ 抗體（稀釋比例均為1∶500），4 ℃孵育過夜，洗片后滴加熒光二抗（稀釋比例1∶1 000），復染淬滅后封片。在熒光顯微鏡下采集圖像，于200 倍放大倍數下計數每個視野中GRα、GRβ 陽性細胞數（二者陽性表達均呈綠色熒光），同一張切片計數5個視野，計數平均每個視野中的陽性細胞數，作為該樣本的陽性細胞數進行結果分析。

2.4.2 耳部皮膚組織中GRα、GRβ蛋白表達水平檢測

取小鼠左耳部皮膚組織，采用組織勻漿細胞裂解法提取核蛋白和總蛋白，采用Western blot 法檢測核蛋白中GRα 蛋白表達水平及總蛋白中GRβ 蛋白表達水平。以BCA 法測定蛋白濃度，用裂解液調整蛋白濃度至6.25 mg/mL，沸水浴中變性5 min。取50 μg變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（在80 V電壓下電泳30 min，然后調整電壓至120 V 繼續電泳120 min），濕法轉膜（電壓70 V，轉膜時間70 min），以5%BSA封閉1 h；分別加入GRα、GRβ、GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶500），4 ℃孵育過夜；次日室溫復溫1 h，以TBST 清洗5 min×6 次，加入二抗（稀釋比例1∶1 000），室溫孵育2 h；再以TBST 清洗5 min×6 次，加入ECL 發光液，采用凝膠成像系統曝光顯影，并用系統自帶的軟件測定條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值作為該樣本中目的蛋白的相對表達水平。

2.5 耳部皮膚組織中AKT/S6K1 信號通路相關蛋白表達的檢測

采用Western blot 法檢測。取小鼠左耳部皮膚組織，采用組織勻漿細胞裂解法提取總蛋白，具體方法及步驟同“2.4.2”項下。其中，Gαi1、Gαi3、S6K1、p-S6K1、AKT1/2、p-AKT 一抗的稀釋比例均為1∶500，二抗的稀釋比例為1∶1 000。

2.6 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。符合正態分布且方差齊的數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 小鼠左耳外觀及耳組織病理學觀察結果

A組小鼠左耳部皮膚外觀無明顯紅腫等炎癥表現；顯微鏡下顯示該組小鼠左耳部皮膚表皮層細胞層次清晰、排列規整，真皮層無明顯血管擴張及炎癥細胞浸潤。B組小鼠左耳部皮膚紅腫、增厚、脫屑，部分區域潰爛；顯微鏡下顯示該組小鼠左耳部皮膚表皮層明顯增厚，角化過度伴角化不全，真皮層血管擴張，大量炎癥細胞浸潤。C、D組小鼠的左耳部皮膚紅腫程度、過度角化現象及炎癥細胞浸潤程度相較于B組均明顯減輕。E組小鼠的左耳部皮膚炎癥表現趨于消退，過度角化現象消失，炎癥細胞浸潤極少。結果見圖1（C、D組圖略）。

圖1 各組小鼠左耳部皮膚外觀及耳組織病理學觀察的顯微圖

統計分析結果顯示，與A組[（8.2±1.6） μm]比較，B組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度[（64.5±7.2） μm]顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度[分別為（39.1±5.4）、（34.5±5.0）、（20.9±3.5） μm]均顯著減小（P＜0.05）；與C組比較，E組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度顯著減小（P＜0.05）。

3.2 小鼠血清中IgE、IL-4水平測定結果

與A 組比較，B 組小鼠血清中IgE、IL-4 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠血清中IgE、IL-4水平均顯著降低（P＜0.05）；與C組比較，E組小鼠血清中IgE、IL-4水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠血清中IgE、IL-4 水平測定結果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠血清中IgE、IL-4 水平測定結果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

IL-4/（pg/mL）304.1±41.8 836.4±86.4a 610.1±74.2b 641.7±50.0b 485.9±60.7bc組別A組B組C組D組E組IgE/（pg/mL）316.0±62.3 1 979.5±272.9a 1 271.3±270.5b 1 309.5±244.0b 951.5±299.7bc

3.3 小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達的測定結果

3.3.1 GRα、GRβ陽性細胞數測定結果

與A組比較，B組小鼠GRα陽性細胞數差異無統計學意義（P＞0.05），GRβ陽性細胞數顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C組小鼠GRα陽性細胞數差異無統計學意義（P＞0.05），D、E 組小鼠GRα 陽性細胞數顯著增加（P＜0.05），C組小鼠GRβ陽性細胞數顯著增加（P＜0.05），E組小鼠GRβ陽性細胞數顯著減少（P＜0.05）；與C組比較，D、E 組小鼠GRα 陽性細胞數顯著增加（P＜0.05），GRβ陽性細胞數顯著減少（P＜0.05）。結果見圖2、表2。

表2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達情況的測定結果（±s，n＝10）

表2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達情況的測定結果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組陽性細胞數/個GRα陽性細胞數6.5±1.9 6.7±2.3 7.3±1.9 22.5±1.9bc 29.5±2.9bc GRβ陽性細胞數7.5±1.9 24.8±2.5a 32.2±2.6b 22.7±2.1c 9.5±1.9bc蛋白表達水平GRα/GAPDH 0.276±0.042 0.293±0.039 0.291±0.030 0.462±0.028bc 0.628±0.067bc GRβ/GAPDH 0.253±0.038 0.490±0.034a 0.645±0.070b 0.480±0.050c 0.293±0.039bc

圖2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達的免疫熒光圖

3.3.2 GRα、GRβ蛋白表達水平測定結果

與A組比較，B組小鼠核蛋白中GRα蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），總蛋白中GRβ 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與B組比較，C組小鼠核蛋白中GRα 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），D、E 組小鼠核蛋白中GRα 蛋白水平及C 組小鼠總蛋白中GRβ蛋白表達水平均進一步升高（P＜0.05），E組小鼠總蛋白中GRβ 表達水平顯著降低（P＜0.05）。與C 組比較，D、E 組小鼠核蛋白中GRα 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），總蛋白中GRβ 蛋白水平顯著減低（P＜0.05）。結果見表2、圖3。

圖3 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ蛋白表達的電泳圖

3.4 小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1 信號通路相關蛋白表達的測定結果

與A組比較，B組小鼠Gαi1、Gαi3、p-S6K1、p-AKT的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠Gαi1、Gαi3、p-S6K1、p-AKT的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組小鼠Gαi1、p-S6K1、p-AKT 的蛋白表達水平及E 組小鼠Gαi3 的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

表3 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號通路相關蛋白表達水平測定結果（±s，n＝10）

表3 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號通路相關蛋白表達水平測定結果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

p-AKT/GAPDH 0.288±0.042 0.758±0.081a 0.595±0.077b 0.482±0.050bc 0.448±0.070bc組別A組B組C組D組E組Gαi1/GAPDH 0.274±0.045 0.764±0.066a 0.591±0.067b 0.493±0.042bc 0.452±0.057bc Gαi3/GAPDH 0.296±0.050 0.761±0.063a 0.562±0.084b 0.506±0.036b 0.443±0.037bc S6K1/GAPDH 0.798±0.074 0.834±0.039 0.801±0.054 0.785±0.047 0.813±0.061 p-S6K1/GAPDH 0.280±0.050 0.727±0.043a 0.570±0.053b 0.462±0.067bc 0.477±0.059bc AKT1/2/GAPDH 0.785±0.076 0.812±0.034 0.755±0.049 0.763±0.029 0.778±0.084

圖4 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號通路相關蛋白表達的電泳圖

4 討論

中國醫學科學院的研究人員早在20世紀60年代就對我國境內沙棘的資源分布及藥理作用展開了研究，在后續的動物實驗中證實沙棘油具有抗炎作用且無明顯毒性[14]。近年來，隨著對沙棘研究的深入，更多學者聚焦于沙棘果油的抗炎作用[15]。關于沙棘油在皮膚科的應用，早有報道其除了具有美容功效外，對皮膚燒傷、紫外線損傷、皮炎損傷等也有效，可促進皮膚再生、減輕組織炎癥、促進傷口愈合[16]。在外用GC 進行AD 治療時，即便嚴格遵守用藥規范，仍有可能隨著病程和治療時間的延長出現激素抵抗，影響治療效果[17]。本研究結果顯示，使用DNCB 聯合SEB 刺激后，小鼠皮膚組織炎癥表現明顯，血清IgE、IL-4 水平顯著升高；沙棘果油聯合地塞米松對AD小鼠炎癥反應的抑制作用較二者單獨應用時更為顯著，表現為皮損局部的炎癥表現趨于消退，小鼠血清中IgE、IL-4 水平降低。本研究結果進一步驗證了沙棘果油在皮膚炎癥性疾病中的抗炎作用。

GC需要與細胞內的GRα結合形成復合物轉運至細胞核內方能發揮作用，GRβ是GC負調控因子，能夠抑制GRα 的活性[18]。本課題組通過免疫熒光單標法檢測了各組小鼠皮損部位皮膚組織中GRα、GRβ 陽性細胞數量。結果發現，使用DNCB 聯合SEB 刺激后，小鼠皮膚組織中GRα 陽性細胞數與正常小鼠比較差異無統計學意義，GRβ陽性細胞數顯著增加。作為GC負調控因子，GRβ 陽性細胞數的增加抑制了GC 作用的發揮，促使激素抵抗發生。使用地塞米松（常用的GC 藥物）干預后，AD 小鼠皮膚組織中GRα 陽性細胞數與干預前比較差異無統計學意義，而應用沙棘果油或沙棘果油聯合地塞米松干預后，小鼠皮膚組織中GRα 陽性細胞數顯著增加；單獨應用地塞米松干預時，GRβ 陽性細胞數增加最為顯著，而沙棘果油單用或者聯合地塞米松應用后能夠減少GRβ陽性細胞數，抑制激素抵抗。為了進一步驗證GRα、GRβ 的蛋白表達情況，本課題組分別提取了各組小鼠皮膚組織中的核蛋白和總蛋白，并檢測了GRα、GRβ 蛋白在皮膚組織中的表達情況。結果顯示，使用DNCB聯合SEB刺激后，小鼠皮膚組織核蛋白中GRα蛋白表達水平與正常小鼠比較差異無統計學意義，總蛋白中GRβ 蛋白表達水平顯著升高。應用沙棘果油或沙棘果油聯合地塞米松干預后，AD 小鼠皮膚組織核蛋白中GRα 蛋白表達水平升高，總蛋白中GRβ 蛋白表達水平降低。所得結果與免疫熒光單標法結果互為佐證，證實了沙棘果油對激素抵抗型AD小鼠的GRα、GRβ表達具有調節作用，其可通過上調GRα的表達及入核轉位增強地塞米松的作用，抑制激素抵抗；并且可通過上調GRα的表達及增加地塞米松入核轉位，進一步促進地塞米松發揮作用。G 蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）屬于一大類大型膜蛋白受體，在靜息狀態下能與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白的異源三聚體結合形成G蛋白，而G蛋白包括Gα、Gβ和Gγ這3個亞基。當GPCRs被激活后，受體構象發生變化，Gα與二聚體Gβγ分離，進而啟動信號轉導。Gαi1、Gαi3是Gα亞基中2種重要的蛋白，有研究發現Gαi1、Gαi3 不僅能與GPCRs 結合，還能與胞外配體結合[19]。本研究發現，Gαi1、Gαi3、p-AKT、p-S6K1蛋白在DNCB聯合SEB刺激小鼠中均呈現出表達增加的特點，這表明AKT/S6K1信號通路呈活化狀態，啟動了炎癥反應。單獨使用地塞米松、沙棘果油干預或二者聯合應用時，Gαi1、Gαi3、p-AKT、p-S6K1蛋白表達均呈下降趨勢，與在激素抵抗型AD 小鼠中的表達情況存在顯著差異，其中以地塞米松與沙棘果油聯合應用時降低最為顯著。這表明沙棘果油對激素抵抗型AD小鼠的干預作用可能是通過抑制AKT/S6K1信號通路而發揮的。

綜上所述，沙棘果油對SAg 誘導的AD 小鼠激素抵抗具有干預作用，該作用可能是通過抑制Gαi1/3誘導的AKT/S6K1 信號通路而發揮的。然而，本研究僅限于從動物實驗獲取沙棘果油干預AD 小鼠激素抵抗的證據，對其作用及機制的了解尚淺。本課題組后續擬通過體外實驗對沙棘果油有效成分促使GRα 的入核過程及激活的信號通路進行研究，以進一步探索沙棘果油對AD激素抵抗的干預作用及機制。