小分子抑制劑SYHA1809在比格犬體內的藥動學研究Δ

劉曉琳 ，楊漢煜 ，王小彥 ，康 凱 1，，梁 敏 [1.河北醫科大學藥學院，石家莊 050011；.石藥中奇制藥（石家莊）有限公司，石家莊 050035]

貧血是慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）的一種常見并發癥，可降低患者的免疫力，影響患者的生活質量，甚至會增加血管疾病和死亡的風險[1]。美國心臟協會表示貧血是CKD患者的非傳統心血管危險因素[2]。由于紅細胞生成刺激劑（erythropoiesis-stimulating agents，ESAs）的低反應性和鐵劑治療的諸多不良反應，目前仍有許多腎性貧血患者未得到有效治療，很大比例的CKD合并貧血患者仍然不能達到正常血紅蛋白的水平[3]。低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是細胞適應低氧環境的關鍵性轉錄因子，目前已證實約有100多個基因受其調控，在紅細胞生長、腫瘤生長和血管生長等方面發揮著重要作用[4—5]。脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）作為HIF 依賴性紅細胞生成調節劑的發現，推動了腎性貧血新治療藥物的開發[6]。靶向PHD的小分子抑制劑研究已經成為當前治療貧血/缺血及炎癥等疾病的策略之一。目前全球上市的HIFPHD 抑制劑包括Roxadustat、Molidustat、Daprodustat、Vadadustat、Enarodustat 5個產品，其中Roxadustat作為國內唯一上市的HIF-PHD抑制劑受到許多質疑，最終未能獲得美國FDA 批準上市[7]。因此，開發結構新穎、藥效更好、安全性更佳的小分子HIF-PHD抑制劑仍然迫切。

SYHA1809 是經石藥集團初篩后獲得的一類創新型HIF-PHD抑制劑，擬用于腎性貧血患者。本研究團隊前期藥效學實驗結果顯示，SYHA1809 對PHD 1～3 均有很強的抑制作用，并能升高人Hep3B 細胞中HIF-1α、HIF-2α 的表達，還可上調正常小鼠和雙腎摘除小鼠（貧血動物模型）血漿紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）濃度，上調順鉑誘導的貧血小鼠的紅細胞和血紅蛋白濃度。基于此，本研究擬以比格犬為研究對象，采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法考察SYHA1809 的藥動學行為，以期為該新藥的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TSQ Quantum Vantage型三重四極桿串聯質譜儀（日本Shimadzu公司）、5804R型高速離心機（德國Eppendorf公司）、H-101型多功能漩渦混合器（上海康禾光電儀器有限公司）、CPA225D型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司 ]。

1.2 主要藥品與試劑

SYHA1809、羅沙司他（內標）對照品（批號分別為20190412、H20190301，純度均大于99.0%）均由石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司提供；二甲基亞砜（DMSO）為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；甲酸、乙酸銨均為色譜級，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康比格犬，體重為6～12 kg，共30只，雌雄各半，購自北京瑪斯生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0002，合格證號為110318210100027738，使用許可證號為SYXK（冀）2021-007。比格犬給藥前禁食不少于12 h，自由飲水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以2 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，45%B；0.5～1.0 min，45%B→75%B；1.0～1.8 min，75%B；1.8～2.0 min，75%B→95%B；2.0～2.5 min，95%B；2.5～2.6 min，95%B→45%B；2.6～3.0 min，45%B）；柱溫為40 ℃；流速為0.4 mL/min；進樣量為1 μL。

2.2 質譜條件

離子源為加熱電噴霧電離源，采用負離子選擇反應監測（selected reaction monitoring，SRM）模式掃描；SYHA1809、內標的離子監測通道分別為m/z418→374.1、351.1→173.1；碰撞能量分別為19、37 V；S-Lens電壓分別為85、89 V；加熱毛細管溫度為320 ℃；碰撞氣壓力為1.5 mTorr。

2.3 溶液的配制

2.3.1 儲備液的配制

取SYHA1809 對照品適量，精密稱定，加DMSO 溶解后，用甲醇稀釋，即得質量濃度為2 mg/mL的儲備液。取內標對照品適量，精密稱定，加DMSO溶解后，用甲醇稀釋，即得質量濃度為1 mg/mL的內標儲備液。上述儲備液均置于－20 ℃保存備用。

2.3.2 系列標準溶液和質控溶液的配制

精密吸取SYHA1809儲備液適量，以50%甲醇倍比稀釋，得到質量濃度分別為400、200、80.0、40.0、10.0、2.00、0.800、0.400 μg/mL的系列標準溶液。另精密吸取SYHA1809 儲備液適量，以50%甲醇稀釋，得到質量濃度分別為320、160、1.20、0.400 μg/mL的質控（QC）溶液。

2.3.3 內標溶液的配制

精密吸取內標儲備液，以50%甲醇稀釋，即得質量濃度為1 000 ng/mL的內標溶液。

2.4 生物樣品預處理

取30 μL 比格犬血漿，加入30 μL 內標溶液和300 μL 乙腈，振搖15 min，以3 700 r/min 離心15 min，取1 μL，按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析。

2.5 方法學驗證

按照《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》[8]和生物樣品分析國際規范的有關要求[9—10]，對比格犬血漿中SYHA1809 的LC-MS/MS 測定方法進行方法學驗證，包括方法的專屬性、準確度與精密度、殘留效應、提取回收率、基質效應、稀釋效應以及穩定性考察。

2.5.1 專屬性考察

采集6 只比格犬給藥前的血漿并混合，得到空白血漿。取空白血漿適量，除不加內標外，其余按“2.4”項下方法處理，然后進樣分析，得空白血漿樣品色譜圖（見圖1A）；取空白血漿適量，加內標同法處理，得空白血漿+內標樣品色譜圖（見圖1B）；取空白血漿適量，加入定量下限質量濃度（20 ng/mL）的SYHA1809溶液，按“2.4”項下方法處理，然后進樣分析，得定量下限血漿樣品色譜圖（見圖1C）；取空白血漿適量，加入定量上限質量濃度（20 000 ng/mL）的SYHA1809溶液，除不加內標外，其余同法處理，得不含內標的定量上限血漿樣品色譜圖（見圖1D）；取比格犬灌胃給藥8 h 后的血漿樣品，同法處理，得灌胃給藥8 h后血漿樣品色譜圖（見圖1E）。結果顯示，SYHA1809 與內標的保留時間分別為1.38、1.40 min，空白血漿樣品中內源性物質和內標均不干擾待測物的測定。

圖1 專屬性考察的LC-MS/MS圖

2.5.2 標準曲線考察

取一定量的系列標準溶液，用空白血漿稀釋20 倍后，得到質量濃度為20 000、10 000、4 000、2 000、500、100、40、20 ng/mL 的系列標準樣品溶液，按“2.4”項下方法操作后，進樣分析。以血漿樣品溶液中SYHA1809的質量濃度為橫坐標（X）、SYHA1809 與內標的峰面積比值為縱坐標（Y），采用加權最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.000 921X－0.00 140（r2＝0.995 8），SYHA1809的線性范圍為20～20 000 ng/mL。

2.5.3 準確度與精密度考察

取質量濃度分別為0.400、1.20、160、320 μg/mL 的QC溶液，用空白血漿稀釋20倍后，得到質量濃度分別為20.0、60.0、8 000、16 000 ng/mL的QC樣品溶液。取上述溶液各30 μL，按“2.4”項下方法處理，每一質量濃度平行6 個樣本，連續測定3 個分析批，根據當日的標準曲線，計算QC樣品溶液的測得濃度，考察本方法的準確度與精密度。結果顯示，各質量濃度QC 樣品溶液的準確度為90.1%～107.2%，批內精密度的RSD為0.9%～8.2%（n＝6），批間精密度的RSD 為2.3%～7.4%（n＝18）。SYHA1809在定量下限質量濃度下的準確度為86.5%～112.3%，日內RSD 為4.2%～8.2%（n＝6），日間RSD 為7.4%（n＝18）。上述結果表明批內與批間的準確度和精密度均符合生物樣品分析方法驗證的要求。

2.5.4 殘留效應考察

將空白血漿樣品按“2.4”項下方法處理，在方法驗證每一個分析批的定量上限樣品分析結束后，立即進行空白血漿樣品分析，考察高濃度樣品殘留對測定的影響。結果顯示，空白血漿中待測物響應低于定量下限的20%，內標響應低于定量下限的5%，表明該方法條件下，待測物和內標均無殘留效應。

2.5.5 提取回收率考察

配制SYHA1809 低、中、高質量濃度（60.0、8 000、16 000 ng/mL）的QC 溶液，按“2.4”項下方法處理，每一質量濃度平行6個樣本，記錄峰面積（A）；另將空白血漿進行樣品預處理后，取上清液加入上述不同質量濃度的SYHA1809 QC溶液和內標溶液，每一質量濃度平行6個樣本，記錄峰面積（B）；以A/B計算提取回收率。結果顯示，低、中、高質量濃度SYHA1809 的提取回收率為（82.8±7.37）%～（84.9±1.30）%，RSD＜15%（n＝6），具體見表1。

表1 SYHA1809的基質效應和提取回收率測定結果

2.5.6 基質效應考察

將6份來源于不同比格犬的空白血漿經樣品預處理后，制備低、高質量濃度（60.0、16 000 ng/mL）的QC 樣品，按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析后，計算SYHA1809與內標的峰面積比值（C）；以水代替空白血漿，同法操作后進樣分析，計算SYHA1809與內標的峰面積比值（D）；以C/D計算得經內標歸一化的基質因子。結果顯示，低、高質量濃度SYHA1809 的基質效應分別為（90.2±5.90）%、（90.2±0.90）%，RSD＜15%（n＝6）。

2.5.7 稀釋效應考察

取SYHA1809儲備液適量，用50%甲醇稀釋成質量濃度為1 600 μg/mL 的溶液，用比格犬空白血漿稀釋20倍后得到質量濃度為80 000 ng/mL的QC樣品。取上述QC 樣品，再用比格犬空白血漿稀釋5 倍，平行稀釋6 個樣本；按“2.4”項下方法處理，再根據當日標準曲線進行計算。結果顯示，SYHA1809的準確度為99.9%，RSD為2.2%（n＝6），表明SYHA1809 的QC 樣品經空白血漿稀釋5倍后不影響測定結果的準確性。

2.5.8 穩定性考察

取低、高質量濃度（60.0、16 000 ng/mL）的QC 樣品溶液，考察其室溫放置24 h、蛋白沉淀后室溫放置24 h、自動進樣器（4 ℃）放置24 h、－70 ℃～室溫反復凍融5次、－70 ℃凍存58 d 的穩定性，按“2.4”項下方法處理，每一質量濃度平行6個樣本。結果顯示，考察樣品在上述條件下穩定性良好，準確度偏差均在±15%以內，具體見表2。

表2 SYHA1809在血漿中的穩定性

2.6 藥動學研究

將比格犬隨機分為單次靜脈給藥組（3.75 mg/kg）、單次低劑量灌胃組（3.75 mg/kg）、單次中劑量灌胃組（7.5 mg/kg）、單次高劑量灌胃組（15 mg/kg）和多次灌胃組（7.5 mg/kg，每天1次，連續7 d），每組6只，雌雄各半。給藥前各組比格犬禁食不少于12 h，自由飲水；給藥后4 h統一進食（包括多次給藥在內的所有組別，均在給藥前禁食）。各單次灌胃組和多次灌胃組分別在給藥第1天和第7 天的給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12、24 h時經四肢靜脈取血0.6 mL，單次靜脈給藥組于給藥前和給藥后5 min 和0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24 h時經四肢靜脈取血0.6 mL，置于EDTAK2抗凝試管中，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。采用Phoenix WinNonlin 8.0軟件的非房室模型計算各組比格犬給藥后的藥動學參數，再用Graph-Pad Prism 8.0軟件繪制各組比格犬給予SYHA1809后的平均血藥濃度-時間曲線。結果見圖2、圖3、表3。

表3 各組比格犬給予SYHA1809后的藥動學參數比較（±s，n＝6）

表3 各組比格犬給予SYHA1809后的藥動學參數比較（±s，n＝6）

NA：無相應數據。

藥動學參數tmax/h cmax/（μg/mL）AUC0-t/（μg·h/mL）AUC0-∞/（μg·h/mL）MRT0-∞/h t1/2/h CL[mL/（min·kg）]單次靜脈給藥組NA NA 22.53±5.69 23.90±4.89 4.77±1.09 3.35±1.36 2.70±0.48單次低劑量灌胃組0.54±0.37 6.68±2.56 19.05±5.41 19.97±6.55 5.49±2.20 3.65±2.73 NA單次中劑量灌胃組0.50±0.27 10.51±1.06 38.75±12.75 39.61±12.89 5.53±1.46 4.04±1.37 NA單次高劑量灌胃組0.54±0.25 21.04±3.88 101.30±25.50 101.83±25.53 6.46±1.26 3.28±1.21 NA多次灌胃組0.63±0.31 12.80±4.23 43.08±4.90 44.72±4.97 6.39±2.19 4.28±2.19 NA

圖2 比格犬靜脈給藥后血漿中SYHA1809的平均血藥濃度-時間曲線（n＝6）

圖3 比格犬單次及多次灌胃給藥后血漿中SYHA1809的平均血藥濃度-時間曲線（n＝6）

由表3可知，靜脈注射給藥后，SYHA1809在比格犬體內的CL為（2.70±0.48） mL/（min·kg），相當于比格犬肝臟血流量[約31 mL/（min·kg）[11]]的8.7%；穩態分布體積（steady-state distribution volume，Vss）為0.757 L/kg，高于比格犬體液總量（0.6 L/kg[11]）；t1/2為（3.35±1.36） h，表明SYHA1809在比格犬體內清除率低，廣泛分布于比格犬體內。單次灌胃給藥后，低、中、高劑量的SYHA1809在比格犬體內的平均tmax為（0.53±0.02） h，血藥濃度隨給藥劑量的增加而升高，3 個劑量的cmax分別為（6.68±2.56）、（10.51±1.06）、（21.04±3.88）μg/mL，給藥24 h后均降至峰濃度的1/20 以下。單次灌胃給予3.75 mg/kg的SYHA1809 后，以AUC0-∞計算SYHA1809 的絕對生物利用度為83.5%，表明SYHA1809 灌胃給藥的生物利用度高。另外，在3.75～15 mg/kg劑量范圍內，SYHA1809的cmax和AUC增加與劑量呈正相關，cmax增加比例略低于劑量增加比例，AUC 增加比例略高于劑量增加比例（回歸方程斜率為0.90～1.10 時，判斷為正相關[12]）。SYHA1809 連續以7.5 mg/kg 灌胃7 d 后，與同劑量單次灌胃給藥后的藥動學參數相當，差異無統計學意義（P＞0.05），其中cmax、AUC0-t分別為同劑量單次灌胃給藥后的1.22、1.11 倍，表明SYHA1809 在比格犬體內無明顯蓄積。

3 討論

本研究建立了測定比格犬血漿中SYHA1809 含量的LC-MS/MS 法，血漿樣品經沉淀蛋白處理后，采用加熱電噴霧電離源，以SRM 掃描方式進行定量分析。結果顯示，血漿樣品中的內源性物質不干擾SYHA1809的測定，SYHA1809的檢測線性范圍為20～20 000 ng/mL，表明本方法具有快速、準確、靈敏度高的特點，可用于SYHA1809在比格犬體內的藥動學研究。

HIF-PHD抑制劑是目前極具潛力的貧血治療藥物。在臨床前藥動學研究中，Roxadustat 在動物體內吸收速度快、半衰期較短、分布容積小[13—14]。SYHA1809的藥動學行為與Roxadustat相似，靜脈給藥后，SYHA1809在比格犬體內為低清除藥物，CL 約為比格犬肝臟血流量的8.7%，且Vss較高，體內分布廣泛；灌胃給藥后，SYHA1809在比格犬體內的吸收速度很快，1 h內即可達峰，t1/2約為3～5 h；當灌胃3.75 mg/kg 的SYHA1809 后，其絕對生物利用度為83.5%。3.75～15 mg/kg 的SYHA1809 單次灌胃給藥后在比格犬體內為非線性動力學過程。7.5 mg/kg的SYHA1809連續灌胃7 d后與同劑量單次灌胃給藥后相比，其在比格犬體內無明顯蓄積。

綜上所述，小分子抑制劑SYHA1809在比格犬體內吸收迅速，血藥濃度呈劑量依賴性，生物利用度高，多次灌胃給藥后無明顯蓄積，藥動學行為良好。

（利益聲明：本文作者無利益沖突）