基于代謝組學探討快松飲防治便秘的作用機制Δ

于小聰 ，劉沈林 ，王澤琨 ，李丹婷 ，趙毅萌 ，陳 辰 ，陳亞軍 ，束雅春 #（.南京中醫藥大學附屬醫院藥學部，南京 009；.南京中醫藥大學附屬醫院脾胃病科，南京 009；.南京市婦幼保健院檢驗科，南京 0004）

便秘是一種影響患者健康和生活質量的常見慢性疾病，在人群中的發病率為2%～28%。隨著年齡的增長，便秘的患病率明顯升高，老年人群中有15%～20%為便秘患者，其中女性要多于男性[1—2]。長期的便秘不僅會造成患者生活質量下降，同時還會危害患者的身體健康，如誘發心腦血管疾病、引起胃腸功能紊亂、引起或加重直腸肛門疾病或結腸癌等[3—4]。化學藥物針對便秘的治療雖然可以有效緩解癥狀，但是從長期來看會引起很多副作用，產生藥物依賴。而中醫藥治療便秘已有上千年歷史，近年來中醫藥治療慢性功能性便秘的報道逐漸增多。循證醫學研究證實，中醫藥在治療功能性便秘方面安全、有效，能改善功能性便秘患者的臨床癥狀，在總體療效方面較化學藥具有明顯優勢[5]。

快松飲（原麻仁通顆粒）由火麻仁、郁李仁、萊菔子、黑芝麻4味中藥組方而成，是江蘇省中醫院全國名中醫劉沈林教授在從醫40 余年的經驗中總結而得的用于治療便秘的經驗方。該方臨床療效確切，但成分與作用機制尚不清楚。代謝組學可以通過定性、定量方法分析生物體受外界刺激或擾動后體內所有代謝物的變化[6]，這與中醫藥治療疾病的“整體觀”相符。本研究擬采用慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）動物模型來研究快松飲改善便秘的效果，然后利用超高效液相色譜-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術對大鼠血清、尿液進行代謝組學分析，探討快松飲改善便秘的作用機制，為其后續研究提供科學的實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：ExionLC 型UPLC 儀、QTof 5600+型高分辨質譜儀（美國AB SCIEX 公司），Heraeus Megafuge 8R 型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），CPA225D 型電子天平（德國Sartorius公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：快松飲（江陰天江藥業有限公司，批號20210321，規格6 g/包），麻仁軟膠囊（佛山手心制藥有限公司，批號2101524，規格0.6 g/粒），復方地芬諾酯片（常州康普藥業有限公司，批號2005020，規格為每克含鹽酸地芬諾酯2.5 mg、硫酸阿托品0.025 mg）；乙腈、甲醇均為質譜級，甲酸為分析級，水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物有SPF 級ICR 雄性小鼠120 只（體重20～24 g）和SPF 級SD 雄性大鼠39 只（體重180～200 g），均由南通大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK（蘇）2019-0001。動物均于溫度（22±4） ℃、相對濕度（55±15）%的條件下飼養。本動物實驗經南京中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會批準后實施（批件號為2021DW-13-01）。

2 方法

2.1 小鼠藥效實驗

2.1.1 小鼠腸推進實驗

將60 只小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性對照組（麻仁軟膠囊0.64 g/kg，相當于10.6 倍臨床等效劑量），快松飲低、中、高劑量組（3.2、6.4、12.8 g/kg，分別為2.7、5.3、10.6 倍臨床等效劑量），每組10 只。空白組和模型組小鼠灌胃等體積水，各給藥組小鼠灌胃相應藥物（均以蒸餾水為溶劑配制藥液）；每天給藥1 次，連續14 d。實驗期間小鼠自由飲食、攝水，每周記錄其體重。第14天灌胃結束后，各組小鼠禁食不禁水24 h。在第15 天，以墨汁為溶劑配制各組藥液，空白組小鼠灌胃等體積水，其余各組小鼠均先灌胃復方地芬諾酯片（4 mg/kg，以水為溶劑）[7]，建立STC 小鼠模型。30 min 后，各給藥組小鼠再次灌胃相應藥物（以墨汁為溶劑），模型組和空白組小鼠灌胃等體積墨汁。25 min 后立即脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度并記為小腸總長度；從幽門至墨汁前沿的距離為墨汁推進長度。計算墨汁推進率：墨汁推進率（%）＝墨汁推進長度（cm）/小腸總長度（cm）×100%。

2.1.2 小鼠排便實驗

另取60 只小鼠按“2.1.1”項下方法分組、造模、給藥和灌胃墨汁。每只小鼠單獨放在籠內飼養，籠底放置1張白紙。從灌胃墨汁時開始計時，記錄每只小鼠首次排便時間，并記錄和觀察小鼠5 h內的糞便質量和糞便數量。

2.2 大鼠代謝組學研究

2.2.1 分組、造模與給藥

將39 只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（麻仁軟膠囊0.36 g/kg，相當于6 倍臨床等效劑量）和快松飲低、高劑量組（快松飲2.4、4.8 g/kg，分別為3、6倍臨床等效劑量）。空白組大鼠為7只，其余各組大鼠均為8只。適應性喂養3 d后，空白組大鼠灌胃水，其余各組大鼠灌胃復方地芬諾酯片（8 mg/kg，溶劑為水）建立STC模型[8]，連續灌胃14 d。每天觀察大鼠生活、毛發狀態，第14天灌胃完成后，將大鼠放入代謝籠中收集其24 h糞便，記錄糞便數量及質量。若空白組與模型組大鼠24 h糞便數量、質量差異均具有統計學意義則表明造模成功[8]。造模成功后，空白組大鼠繼續灌胃水；其余各組大鼠均先灌胃復方地芬諾酯片（8 mg/kg），1 h 后模型組大鼠灌胃水，其余各給藥組大鼠灌胃相應藥物（以水為溶劑）；每天灌胃水/藥物1次，連續1周。實驗期間讓大鼠自由飲食、攝水，每周記錄其體重。

2.2.2 生物樣本收集及處理

末次灌胃后將大鼠放入代謝籠，第2 天收集其24 h尿液、糞便，分裝放置于－80 ℃冰箱中儲存備用。收集尿液和糞便后，空白組大鼠灌胃水；模型組大鼠灌胃復方地芬諾酯片；給藥組大鼠先灌胃復方地芬諾酯片，1 h后灌胃相應藥物。30 min后采集各組大鼠眼眶血，將血樣于室溫下放置1 h，以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，再在4 ℃下以14 000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝，在－80 ℃冰箱中儲存備用。

2.2.3 血清樣品的制備

取－80 ℃冰箱中凍存的血清樣本，室溫解凍。取200 μL 解凍后的血清樣本于2 mL 離心管中，加入600μL 乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，轉移至2 mL 離心管中，室溫下氮吹至干。殘渣加入100 μL乙腈復溶，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，待測。取上述39 只大鼠血清樣本各40 μL于10 mL離心管中混合，加入4 680 μL乙腈，按血清樣品的處理方式處理，室溫下氮吹至干。殘渣加入780 μL乙腈復溶，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，得到質量控制（quality control，QC）樣本。

2.2.4 尿液樣品的制備

取－80 ℃冰箱中的尿液樣本，室溫解凍。取400μL 解凍的尿液樣本于2 mL 離心管中，加入1 200 μL 乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，轉移至2 mL 離心管中，室溫下氮吹至干；殘渣加入300 μL 乙腈復溶，于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測。取上述39 只大鼠尿液樣本各50 μL 于10 mL 離心管中混合，加入5 850 μL 乙腈，按上述尿液樣品處理方式處理，室溫下氮吹至干；殘渣加入1 463 μL 乙腈復溶，于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，得到QC樣本。

2.2.5 色譜與質譜條件

色譜條件：采用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以0.05%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～2 min，15%B→18%B；2～7 min，18%B→35%B；7～10 min，35%B→55%B；10～22 min，55%B→82%B；22～23 min，82%B→99%B；23～24 min，99%B；24～24.1 min，99%B→15%B；24.1～27 min，15%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：數據采集選用全掃描自動模式，離子源為電噴霧離子源（ESI），在正（ESI+）、負（ESI－）離子模式下掃描，掃描范圍為質荷比（m/z）50～1 000。噴霧氣壓力為55 psi，輔助加熱氣壓力為55 psi，氣簾氣壓力為35 psi；溫度為500 ℃；離子化電壓為±4 500 V，去簇電壓為50 eV（ESI+）、－60 eV（ESI－） eV；TOF-MS模式下設置碰撞電壓為±10 eV；IDA-MS/MS 條件下設置碰撞電壓為±35 eV，碰撞電壓差為±15 eV。

2.2.6 數據處理

將采集所得代謝組學質譜原始數據通過Analysis Base File Converter軟件轉化為.abf格式的文件，隨后通過MS-DAIL3.9軟件以及SEERF平臺（https：//slfan2013.github.io/SERRF-online/）進行色譜峰對齊、峰過濾、歸一化預處理，然后將數據導入SIMCA 14.1 軟件進行偏最小二乘-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）以及正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），根據各樣本聚集情況篩選離群樣本。將篩選后的各組數據導入MetaboAnalyst 5.0 在線軟件，當2 組代謝物差異倍數（fold change，FC）＞1.2且P＜0.05或FC＜0.833 3且P＜0.05 時，提示該代謝物可能為潛在的差異代謝物[6]。結合人類代謝組數據庫（HMDB，https：//hmdb.ca），將已鑒定的內源性差異代謝物利用MetaboAnalyst 5.0軟件進行富集分析以及相關代謝通路分析。

2.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統計分析。實驗結果以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 小鼠藥效學實驗結果

3.1.1 小鼠腸推進實驗結果

與空白組比較，模型組小鼠墨汁推進率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和快松飲高劑量組小鼠墨汁推進率顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠的腸推進實驗結果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠的腸推進實驗結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組快松飲低劑量組快松飲中劑量組快松飲高劑量組墨汁推進率/%89.9±5.6 85.0±3.9a 92.0±7.7b 88.5±7.5 89.1±7.7 91.0±6.3b小腸總長度/cm 56.6±5.3 55.0±2.9 56.3±2.7 55.7±2.6 58.8±1.6 60.4±4.4墨汁推進長度/cm 50.8±4.7 46.8±3.8 51.8±5.2 49.4±5.7 52.4±4.8 54.8±3.6

3.1.2 小鼠排便實驗結果

與空白組比較，模型組小鼠首次排便時間顯著延長，5 h 內排便質量和排便數量均顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組和快松飲中、高劑量組小鼠的首次排便時間顯著縮短（P＜0.05 或P＜0.01），5 h 內排便質量顯著增加（P＜0.01）；陽性對照組和快松飲高劑量組小鼠5 h 內排便數量顯著增加（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠的排便實驗結果（±s，n＝10）

表2 各組小鼠的排便實驗結果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組快松飲低劑量組快松飲中劑量組快松飲高劑量組首次排便時間/min 77.5±16.5 147.4±14.0a 125.6±12.0b 132.4±26.8 128.4±21.1c 123.7±25.5c 5 h內排便質量/g 0.6±0.2 0.3±0.1a 0.5±0.1b 0.4±0.1 0.5±0.1b 0.5±0.1b 5 h內排便數量/粒18.9±3.9 13.8±3.4a 17.9±4.1 c 15.1±1.3 15.6±3.0 18.1±3.6 c

3.2 大鼠血清代謝組學分析結果

3.2.1 大鼠血清PLS-DA結果

大鼠血清PLS-DA分析圖見圖1。結果顯示，QC樣本在ESI+模式下聚集良好，表明該檢測方法具有良好的穩定性與重復性，檢測系統可靠。空白組散點與模型組散點分開，且快松飲高、低劑量組與模型組相比更趨于空白組，說明經過治療后，大鼠的代謝紊亂趨于正常。

圖1 不同檢測離子模式下各組大鼠血清的PLS-DA圖

3.2.2 血清差異代謝物篩選及通路富集分析結果

大鼠血清OPLS-DA 分析圖見圖2。結果顯示，在ESI－模式下，模型組與空白組的R2X（表示所建模型對X矩陣的解釋概率）、R2Y（表示所建模型對Y矩陣的解釋概率）、Q2（表示模型的預測能力）分別為0.911、1.000、0.896，模型組與快松飲高劑量組的R2X、R2Y、Q2分別為0.878、1.000、0.785；在ESI+模式下，模型組與空白組的R2X、R2Y、Q2分別為0.777、0.978、0.757，模型組與快松飲高劑量組的R2X、R2Y、Q2分別為0.723、1.000、0.504。以FC＞1.2 且P＜0.05 或FC＜0.8333 且P＜0.05 為篩選條件，共鑒定出16個差異代謝物。與空白組比較，模型組大鼠血清中脯氨酸、環（L-脯氨酸-L-纈氨酸）、丙酰基肉堿等10 種差異代謝物的水平均顯著下調（P＜0.05），硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿、琥珀酰二水楊酸、α-甲基間酪氨酸等6種代謝物的水平均顯著上調（P＜0.05）；與模型組比較，快松飲高劑量組大鼠血清中上述差異代謝物的水平均顯著回調（P＜0.05）。結果見表3。

圖2 不同離子模式下各組大鼠血清的OPLS-DA圖

表3 大鼠血清內源性差異代謝物分析結果

將16 個差異代謝物的HMDB ID 導入MetaboAnalyst 5.0在線軟件進行KEGG通路分析，共得到6條代謝通路，主要涉及鞘糖脂生物合成-球狀和異球狀系列、鞘糖脂生物合成-神經節系列、鞘磷脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、鞘糖脂生物合成-乳糖和新內酯系列、氨酰-tRNA生物合成等生物途徑。結果見圖3。

圖3 大鼠血清中差異代謝物的通路富集分析圖

3.3 大鼠尿液代謝組學分析結果

3.3.1 大鼠尿液PLS-DA結果

大鼠尿液PLS-DA 結果見圖4。結果顯示，空白組和模型組的散點區域與各給藥組的散點區域分開，且給藥組的散點位于空白組與模型組之間，快松飲高、低劑量組與模型組相比更靠近空白組，說明經過治療后，大鼠紊亂的代謝已趨于正常。

圖4 不同檢測離子模式下各組大鼠尿液的PLS-DA圖

3.3.2 尿液差異代謝物篩選及通路富集分析

大鼠尿液OPLS-DA圖見圖5。結果顯示，在ESI－模式下，空白組與模型組的R2X、R2Y、Q2分別為0.580、0.994、0.627，模型組與快松飲高劑量組的R2X、R2Y及Q2分別為0.726、1.000、0.712；在ESI＋模式下，空白組與模型組的R2X、R2Y、Q2分別為0.689、0.994、0.621，模型組與快松飲高劑量組的R2X、R2Y、Q2分別為0.851、1.000、0.942。以FC＞1.2 且P＜0.05 或FC＜0.833 3 且P＜0.05為篩選條件，共鑒定出 20 個差異代謝物。與空白組比較，模型組大鼠尿液中硬脂酰磷脂酰膽堿、N-羧甲基天冬氨酸、硬脂酸等5 種差異代謝物的水平均顯著下調（P＜0.05），L-纈氨酸、黃嘌呤酸、前列腺素A2等15 種差異代謝物的水平均顯著上調（P＜0.05）；與模型組比較，快松飲高劑量組大鼠尿液中20 種差異代謝物的水平均顯著回調（P＜0.05）。結果見表4。

圖5 不同離子模式下各組大鼠尿液的OPLS-DA圖

表4 大鼠尿液中內源性差異代謝產物分析結果

將20 個差異代謝物的HMDB ID 導入MetaboAnalyst 5.0 在線軟件進行KEGG 通路分析，共得到8 條代謝通路，代謝途徑主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，泛酸鹽和輔酶A 生物合成，不飽和脂肪酸生物合成，鞘磷脂代謝，丙酮酸代謝等。結果見圖6。

圖6 大鼠尿液中差異代謝物的通路富集分析圖

4 討論

便秘在中醫理論中屬于“便秘”“脾約”“秘結”等范疇，《黃帝內經》最早提出“大便難”“不便”，也有文獻提出“燥結”“脾約”“后不利”等[9—10]。中醫基礎理論認為，便秘的基本病機為氣滯、寒凝、熱結、氣血陰陽虧虛；發病關鍵為大腸傳導功能失常；病位在腸，與肝、腎、脾、胃、肺等臟腑有關[11—12]。快松飲由火麻仁、郁李仁、黑芝麻、萊菔子等藥材加工而成。其中，火麻仁為君藥，其質潤而甘平，具有潤燥滑腸之效，為老人、虛人、產后所致津虧血虛常用藥；郁李仁為臣藥，其味辛甘苦而性平，入脾、大腸、小腸經，主治腸燥便秘；萊菔子辛甘平，歸肺、脾、胃經，為消食除脹、脘腹脹痛、大便秘結之要藥；黑芝麻味甘，性平，歸肝、腎、大腸經，具有益血潤腸、通便的功效，常用于頭暈眼花、腸燥便秘。以上4味中藥合用，共奏潤腸燥、益精血、補肝腎之效。在小鼠腸推進實驗和小鼠排便實驗中，快松飲高劑量組小鼠的墨汁推進率和排便情況均模型組明顯改善，表明快松飲可以明顯改善STC模型小鼠的便秘情況。

本研究通過對STC 模型大鼠的血清和尿液樣本進行代謝輪廓描述，通過代謝物及代謝通路分析，發現了36種差異代謝物和14條代謝通路。L-纈氨酸是一種支鏈氨基酸，血清中支鏈氨基酸濃度的升高會激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，促進氧化應激與炎癥發生，加重便秘程度[13]。硬脂酰磷脂酰膽堿和硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿均為內源性脂質分子，有研究表明，二者與炎癥相關：腸黏液中硬脂酰磷脂酰膽堿含量降低會導致黏液屏障被打破，細菌入侵，造成腸道炎癥發生[14]；硬脂酰磷脂酰膽堿可減少腫瘤壞死因子的分泌，從而抑制腫瘤壞死因子誘導的促炎因子上調[15]。在炎癥條件下，硬脂酰磷脂酰膽堿能夠被磷脂酶A2水解為硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿，因此硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿可以被看作一種便秘炎癥的生物標志物[16]。便秘的發生常常伴隨著腸道炎癥的發生，前列腺素A2作為炎癥因子，其水平在模型組大鼠尿液中上調可以側面印證這一點[17]。結合血清和尿液2 種代謝組學結果來看，造模后大鼠有炎癥發生，模型組大鼠尿液中硬脂酰磷脂酰膽堿較空白組顯著下調，血清中硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿較空白組顯著上調；經快松飲治療后，大鼠的炎癥減輕，尿液中硬脂酰磷脂酰膽堿和血清中硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿水平均顯著回調。

血清和尿液代謝組學通路富集涉及了精氨酸、脯氨酸代謝途徑和異亮氨酸、纈氨酸代謝途徑等多種氨基酸的代謝途徑。氨基酸不僅可以改善腸道屏障功能和抗炎細胞因子相關蛋白的表達，還可以減少氧化應激和腸道細胞凋亡以及腸道炎癥中促炎細胞因子的表達。精氨酸利用分子氧在內皮一氧化氮合酶的作用下合成一氧化氮，而一氧化氮是胃腸道非腎上腺素能非膽堿能神經末梢的抑制性遞質，可產生抑制性連接電位，從而抑制胃腸動力[18]。鞘磷脂主要來源于飲食和脫落的腸黏膜細胞，當便秘發生時，大便集結在腸道中，排便困難，嚴重時會加重腸黏膜脫落，故而模型組大鼠尿液中的鞘磷脂水平上調。

綜上所述，本研究運用代謝組學技術明確了快松飲可通過回調硬脂酰溶血性磷脂酰膽堿、硬脂酰磷脂酰膽堿、前列腺素A2、L-纈氨酸、脯氨酸等差異代謝物以及調節多種氨基酸代謝途徑、鞘磷脂代謝通路等來發揮改善便秘的作用。