基于Cyt b基因序列的江淮下游湖泊鰱群體遺傳多樣性分析

李大命，劉燕山，唐晟凱，殷稼雯，谷先坤，蔣琦辰，蔡永久，張彤晴

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇省內陸水域漁業資源重點實驗室，南京 210017；2.中國科學院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環境國家重點實驗室，南京 210008）

遺傳多樣性即基因多樣性，存在于生物個體內、單個物種內及物種間，是生物生存和進化的基礎，種內的遺傳多樣性與該物種對環境的適應能力呈正向線性關系［1］。遺傳多樣性是評價自然生物資源的重要依據，認識物種的遺傳多樣性對于科學制定物種管理和保護措施具有重要指導意義［2］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是細胞核外具自主復制、轉錄和翻譯能力的遺傳因子，具有分子小、結構簡單、母系遺傳、不易發生基因重組且進化速度快等特點，因此成為研究動物系統發育和群體遺傳學的理想分子標記［3-4］。其中，Cytb基因是線粒體DNA的13個蛋白質編碼基因之一，其結構和功能較為清楚，進化速度適中，且有通用引物便于擴增和測序，目前已廣泛應用于水生動物尤其是魚類的遺傳多樣性和遺傳結構研究，研究結果可為魚類資源管理和保護提供參考［5-7］。

鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）是我國“四大家魚”之一，屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鰱亞科（Hypothalmichthyinae），鰱屬，廣泛分布于我國各大水系和湖泊［8］。鰱生長速度快，抗病能力強，養殖成本低，經濟價值高，是我國淡水池塘養殖的主要種類。鰱是典型的濾食性魚類，終生以浮游生物為食，能夠有效抑制藍藻水華發生，改善水體環境質量，因而在水域生態系統中發揮著重要作用［9-10］。鰱屬于江湖洄游型魚類，受過度捕撈、環境污染、江湖阻隔等不利因素的影響，湖泊鰱資源衰退嚴重，個體低齡化、小型化趨勢加劇［11-12］。為增加湖泊鰱資源量，近幾十年來開展了大規模人工增殖放流，這對恢復湖泊漁業資源和修復生態環境起到了重要作用［13］。然而，盲目的人工放流可能會導致物種野生群體遺傳多樣性降低，改變野生群體的遺傳結構，甚至造成遺傳污染［14-15］。因此，應在了解湖泊鰱資源遺傳背景的基礎上科學開展增殖放流［16］。

迄今，有關鰱野生種質資源遺傳多樣性的研究主要集中在長江干流［17-19］，而對湖泊鰱群體的遺傳資源狀況尚缺乏系統認識。長江、淮河下游是我國湖泊集中分布區，也是開展增殖放流的熱點水域，其中鰱是最常見的增殖放流物種之一［13］。本研究選擇線粒體Cytb基因序列作為分子標記，探究長江下游湖泊（太湖、滆湖、長蕩湖和淀山湖）及淮河下游湖泊（高郵湖、洪澤湖、駱馬湖和金沙湖）鰱群體遺傳多樣性和遺傳結構，以期了解相關水域鰱種質資源遺傳多樣性現狀，并為鰱增殖放流、資源管理和保護提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和處理

2019—2020年，采用三重刺網在長江下游流域的太湖（TH）、滆湖（GH）、長蕩湖（CDH）、淀山湖（DSH）及淮河下游流域的高郵湖（GYH）、洪澤湖（HZH）、駱馬湖（LMH）、金沙湖（JSH）共采集鰱樣本239尾，采樣水域及各群體樣本數量見圖1和表1。剪取鰱肌肉組織裝入1.5 mL離心管，加入無水乙醇置于4℃保存備用。

表1 8個鰱群體遺傳多樣性參數Tab.1 Genetic diversity parameters of eight H.molitrix populations

圖1 采樣水域Fig.1 Sam pling water area

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

取肌肉組織，用吸水紙將乙醇吸干。采用廣譜型基因試劑盒（TaKaRa公司）提取基因組DNA，將DNA溶于去離子水，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，測定DNA溶液濃度，將DNA置于-20℃保存備用。采用Cytb基因序列的通用引物L14724（5′-CGTCAGTCCTTTACTT CGCA-3′）和H15915（5′-AGGGCATACTCACGGG GTTG-3′）進行PCR擴增［20］。PCR反應體系總體積為50μL，其中包括2×TaqPCR Master Mix 25 μL，正、反向引物各2μL（10μmol·L-1），DNA模板2μL，ddH2O 19μL。PCR條件為：94℃4 min；94℃40 s，55℃40 s，72℃90 s，循環30次；72℃10 min。

采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，檢測合格的PCR產物送上海生工生物工程技術有限公司進行雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.3 數據處理和分析

采用BioEdit7.0軟件和Clustal X 1.83軟件對序列進行編輯、校對和多重比對，獲得Cytb基因序列。利用DnaSP 5.0軟件計算鰱群體的遺傳多樣性參數：變異位點（variable sites，S）、單倍型數目（haplotype number，N）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、平均核苷酸差異數（average number of nucleotide differences，K）。應用MEGA 7.0軟件統計序列堿基組成，計算群體間的Kimura雙參數遺傳距離，基于鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）構建單倍型系統進化樹，經1 000次自展檢驗獲得分支樹節點的支持率，其余參數均為軟件默認值。采用Network 5.0軟件構建單倍型最小網絡圖。應用Arlequin 3.5軟件進行分子方差分析（AMOVA），計算群體遺傳變異來源、變異方差和遺傳分化指數；開展Tajima’sD和Fu’Fs中性檢驗和核苷酸錯配分布分析，推測鰱群體歷史動態。

2 結果與分析

2.1 Cyt b基因序列組成

本研究獲得8個鰱群體的239條Cytb基因序列，其長度為1 141 bp。分析結果顯示，Cytb序列堿基A、T、G和C的平均含量分別為29.9%、28.4%、13.8%和27.9%，堿基A+T的含量（58.3%）大于G+C的含量（41.7%），表現出明顯的堿基組成偏倚性。239條Cytb序列共檢出變異位點74個，其中單一信息位點13個，簡約信息位點61個，轉換顛換比為13.2，沒有插入和缺失位點。

2.2 群體遺傳多樣性和單倍型組成

8個鰱群體的單倍型多樣性為0.379～0.830，核苷酸多樣性為0.003 98～0.015 84，平均核苷酸差異數為4.54～18.07，其中太湖群體的遺傳多樣性最大，長蕩湖群體的遺傳多樣性最小。8個鰱群平均單倍型多樣性為0.697，核苷酸多樣性為0.010 12，平均核苷酸差異數為11.55（表1）。

239尾鰱個體共定義24種單倍型（Hap1～Hap24），其中太湖群體的單倍型類型最多，有14種，金沙湖群體的單倍型類型最少，僅有5種（表2）。單倍型中Hap3和Hap22為8個群體的共享單倍型，也是優勢單倍型，其個體數量占群體的比例分別為52.3%和10.5%。單倍型Hap1、Hap3、Hap6、Hap9、Hap12、Hap14、Hap18 和Hap19至少為2個群體所有。單倍型Hap2為滆湖群體獨有，單倍型Hap5、Hap7為洪澤湖群體獨有，單倍型Hap8為駱馬湖群體獨有，單倍型Hap10、Hap11、Hap13、Hap15、Hap20、Hap21和Hap23為太湖群體獨有，單倍型Hap24為高郵湖群體獨有（表2）。

表2 單倍型類型及其在8個鰱群體中的分布Tab.2 Hap lotype types and its distribution in eight H.molitrix populations

2.3 群體遺傳結構

分析結果顯示，8個鰱群體間的遺傳距離變化為0.005～0.015，其中太湖群體與金沙湖群體之間的遺傳距離最大，滆湖群體與長蕩湖群體之間的遺傳距離最小。長江流域的4個鰱群體遺傳距離為0.005～0.010，淮河流域的4個鰱群體遺傳距離為0.011～0.014（表3），表明群體間遺傳差異較小。

表3 鰱群體間的遺傳間距離（對角線下）和遺傳分化系數（對角線上）Tab.3 Genetic distance（below diagonal）and genetic differentiation index（above diagonal）among H.molitrix populations

對不同湖泊鰱群體進行分子方差分析，結果顯示，群體間遺傳變異占總變異的2.00%，群體內遺傳變異占總變異的98.00%，遺傳變異主要來自于群體內個體間。將8個群體分為長江流域組群和淮河流域組群，組間遺傳變異占比為1.69%，組內群體間遺傳變異占比為1.01%，群體內遺傳變異占比為97.30%，兩組群遺傳變異主要來自于群體內個體間（表4）。兩兩群體間的遺傳分化指數Fst值為-0.029 23～0.174 33，Fst值統計表明，滆湖群體與駱馬湖和金沙湖群體間有中等和高度遺傳分化（P＜0.05），長蕩湖群體與駱馬湖和金沙湖間有中等和極大遺傳分化（P＜0.05），淀山湖和金沙湖群體間有中等遺傳分化（P＜0.05）（表3），其他群體間無顯著分化（P＞0.05）。

表4 鰱群體內和群體間的分子方差分析結果Tab.4 Results of analysis ofmolecular variance of H.molitrix populations

2.4 單倍型系統樹和最小網絡結構圖

以鳙（Hypophthalmichthysnobilis，HM162839.1）作為外類群，采用鄰接法構建鰱單倍型系統發育樹（圖2）。結果顯示，單倍型被劃分為2個分支，其中單倍型Hap1至Hap21形成一支，單倍型Hap22至Hap24形成一支，這與單倍型最小網絡結構圖相一致（圖3）。最小網絡結構進化關系表明，單倍型Hap1至Hap21之間的步長大多為1，步長最多不超過5，分支單倍型Hap22至Hap24之間的步長最大值為16，最小值為8，而兩個分支相連接的單倍型Hap11和Hap22之間的步長為37，表明單倍型兩個分支之間有較大遺傳差異。單倍型系統樹和網絡結構圖均顯示，鰱各群體的單倍型交叉分布，沒有形成特定的地理遺傳結構。

圖2 基于Cyt b基因的鰱單倍型NJ系統樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of H.molitrix haplotypes based on Cyt b gene

圖3 鰱Cyt b基因單倍型網路結構圖Fig.3 Haplotype network of H.molitrix based on Cyt b gene

2.5 鰱群體歷史動態

中性檢驗結果表明，8個鰱群體的Tajima’sD值為-2.255 64～1.441 97，Fu’Fs值為3.141 17～12.042 16，除長蕩湖和淀山湖群體的Tajima’sD檢驗具有顯著性差異外，其他群體的中性檢驗差異均不顯著（P＞0.05）。將8個群體作為一個整體進行中性檢驗，其Tajima’sD值和Fu’Fs值分別為-0.167 54（P＞0.05）和5.532 78（P＞0.05）（表5），歧點分布曲線呈現為多峰型（圖4），表明鰱群體近期未經歷過群體擴張事件，符合中性進化。

表5 8個湖泊鰱群體的中性檢驗結果Tab.5 Neutral tests of H.molitrix populations in eight freshwater lakes

3 討論

3.1 鰱群體遺傳多樣性

物種的遺傳多樣性是生物長期進化的產物，是其生存適應和發展進化的前提。遺傳多樣性的高低與物種的生存能力和進化潛力密切相關，也反映物種對外界環境因素變化適應能力的強弱。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的兩個重要指標，其值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富［21-22］。本研究結果顯示，8個鰱群體單倍型多樣性為0.379～0.830，核苷酸多樣性為0.003 98～0.015 84。依據GRANT和BOWEN［23］提出的魚類遺傳多樣性大小標準，除長蕩湖群體外，其他鰱群體遺傳多樣性表現出高Hd、高Pi的遺傳多樣性模式，表明鰱資源遺傳多樣性較為豐富。相比較而言，太湖、洪澤湖、駱馬湖及金沙湖群體的遺傳多樣性較高，而長蕩湖、淀山湖、滆湖及高郵湖群體的遺傳多樣性較低，群體間遺傳多樣性表現出明顯差異，這可能受湖泊的生態環境、生產模式及增殖放流等因素影響。近幾十年來，增殖放流已成為恢復漁業資源的重要手段，有關增殖放流對野生群體遺傳多樣性產生的影響一直是國內外學者探討的熱點。研究認為，增殖放流群體比野生群體更容易發生瓶頸效應和近交衰退，進而造成一些稀有等位基因的丟失，導致增殖放流群體平均等位基因數下降，增殖放流群體的遺傳多樣性明顯低于天然群體［14-15，24］。由于增殖放流對象親本來源及遺傳多樣性差異，導致增殖放流對野生群體遺傳多樣性產生較大影響，因此應開展增殖放流對象遺傳多樣性評價，避免增殖放流可能帶來的不利影響［25-27］。整體來看，8個鰱群體的平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.697和0.010 12，明顯低于長江上游鰱群體遺傳多樣性（Hd：0.849，Pi：0.014 38）［28］，且已有研究表明，長江鰱群體目前仍保持較高的遺傳多樣性水平［17-19，29-30］。因此，實現江湖連通是恢復湖泊鰱資源和提高其遺傳多樣性的重要措施。

魚類遺傳多樣性和群體歷史動態有密切聯系，發生過瓶頸效應的群體，遺傳多樣性較低。GRANT和BOWEN［23］提出一個簡化的模式，利用Hd、Pi來估計群體的進化歷史：當Hd≥0.5、Pi≥0.5%時，表示群體穩定，具有較悠久的進化歷史；當Hd≥0.5、Pi＜0.5%時，表示群體是經歷瓶頸效應后迅速擴張而來；當Hd＜0.5、Pi≥0.5%時，表明群體經歷了輕微的瓶頸效應，幾乎沒有影響到核苷酸變異；當Hd＜0.5、Pi＜0.5%時，表明群體近期經歷了瓶頸效應［23］。本研究結果顯示，長蕩湖群體表現出低Hd、低Pi的遺傳模式，顯示群體經歷了嚴重的瓶頸效應；其他群體則表現出高Hd、高Pi的遺傳模式，顯示群體較穩定且具有較長的進化歷史。從中性檢驗結果來看，僅有長蕩湖和淀山湖群體的Tajima’sD檢驗結果具有顯著性負值，其他群體的Tajima’sD和Fu’Fs檢驗結果均沒有顯著性差異。通常認為，Fu’sFs檢驗比Tajima’sD檢驗對群體歷史擴增事件的準確度更高，當Fu’sFs檢驗為不顯著而Tajima’sD為負值時符合中性進化［31-32］，表明鰱群體沒有發生過群擴增歷史事件。另外，錯配分析圖呈多峰分布，也表明群體沒有經歷過種群擴張，較為穩定［33-34］，這也是鰱群體遺傳多樣性較高的重要原因。

3.2 鰱群體遺傳結構分析

了解群體遺傳結構可以用于評價物種群體的變異水平和不同地理群體之間的關系，確定群體中的進化顯著單元和管理單元，科學制定資源的保護和管理策略［35］。遺傳分化指數Fst是表征群體間遺傳分化程度的重要參數，其值越大，表明各群體間的遺傳差異越大：若Fst小于0.05，表明群體間遺傳分化較弱；若Fst為0.05～0.15，表明群體間存在中等分化；若Fst為0.15～0.25，表明群體間遺傳分化較大；若Fst大于0.25，表明群體間分化極大［36］。分子方差分析結果顯示，群體間的分子變異占比較小，而群體內個體間的分子變異占比較大，遺傳分化指數較小，且統計檢驗不具有顯著性差異（Fst=0.019 97，P＞0.05），表明群體間遺傳分化較弱。從群體的單倍型組成、單倍型發育樹及網絡結構圖可以看出，不同群體間存在廣泛的基因交流，沒有形成特定的地理遺傳結構。鰱群體的遺傳結構現狀可能由以下幾個方面的原因造成：1）增殖放流活動可引起野生群體與養殖群體基因參滲，縮小不同地理種群間的遺傳差異，增加群體間的基因交流，從而導致各群體間遺傳結構同質化［19，37］；2）各群體間的地理距離較近，且有河道相連通，群體間沒有形成明顯的地理隔離，南水北調及生產活動則加速了群體擴散和基因交流［38］；3）鰱的游泳能力和適應環境能力較強，可以長距離遷移，適應不同的生態環境［39］；兩兩群體間的Fst值顯示，長江下游4個鰱群體Fst為-0.038 57～0.047 85（P＜0.05），淮河下游4個鰱群體Fst為-0.029 23～0.014 45（P＜0.05），表明長江、淮河流域內群體間遺傳分化極小。兩流域部分群體間呈現出顯著性遺傳分化，比如，滆湖群體與駱馬湖和金沙湖群體間有中等遺傳分化（P＜0.05），長蕩湖群體與駱馬湖群體間也有中等遺傳分化（P＜0.05），而長蕩湖群體與金沙湖群體間有較大遺傳分化（P＜0.01）。因此，應將長江流域和淮河流域鰱群體作為不同的管理單元進行保護。

3.3 湖泊鰱資源管理和保護建議

從群體遺傳多樣性和單倍型組成角度來看，長蕩湖群體遺傳多樣性最低，太湖群體遺傳多樣性最高，單倍型種類最多，且多數單倍型為太湖群體獨有，應對長蕩湖、太湖群體給予重點保護。從群體遺傳結構來看，長江、淮河流域內群體間遺傳分化極弱，而兩流域的部分群體間出現顯著性遺傳分化，因此應將長江流域、淮河流域群體分別作為獨立單元進行管理。增殖放流會對湖泊鰱群體遺傳多樣性和遺傳結構產生重要影響，應開展放流群體和野生群體遺傳多樣性評估，避免增殖放流對自然群體遺傳多樣性和遺傳結構產生不利影響。鰱是典型的江湖洄游型魚類，在長江繁殖產卵，應打通江湖通道，恢復江湖有效連通，將有利于恢復湖泊鰱資源量及提高鰱遺傳多樣性。