脂肪間充質干細胞來源的外泌體在皮膚傷口愈合過程中的作用

胡曉強,張麗君,王 乙,連福治,張 燕

(杭州師范大學 公共衛生學院,浙江 杭州 311121)

皮膚是覆蓋于人體表面最大的器官,由表皮和真皮組成,在抵抗微生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調節體溫等方面發揮著重要作用。皮膚具有一定的自我修復能力,一般損傷后能夠自動愈合。然而糖尿病等慢性疾病患者的皮膚傷口往往較難愈合,不僅影響皮膚正常功能的發揮,而且還會影響美觀,給患者生理和心理上造成雙重影響[1]。皮膚傷口愈合過程可以分為3個既連續又重疊的階段——止血/炎癥期、增生期和重塑期[2],脂肪間充質干細胞來源的外泌體(adipose-derived stem cells-derived exosomes, ADSCs-Exo)在傷口愈合的不同階段發揮著不同的作用。ADSCs-Exo不僅具有調節炎癥的作用,還可以通過促進細胞的增殖、遷移、分化等功能促進傷口的愈合。本文主要對ADSCs-Exo在皮膚傷口愈合過程中的作用進行綜述。

1 ADSCs-Exo的來源及優點

脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cells, ADSCs)是一類脂肪基質內的干細胞群,是一種能夠自我更新并具有多向分化潛能的間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs),能夠在體外分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等。ADSCs主要來源于脂肪細胞,可以利用抽脂術或從切除的脂肪中獲得。與其他類型的MSCs相比,ADSCs的優勢在于易獲取、數量多(1 g脂肪組織提供的干細胞比1 g骨骼所提供的干細胞多500倍),并且具有獨特的免疫調節功能。ADSCs不僅可以通過上調表皮生長因子和血管內皮生長因子的分泌水平來促進皮膚的再生,還可用于修復缺損的骨組織、軟骨和軟組織等[3]。近年來研究發現,ADSCs修復組織的過程實際上是依靠旁分泌作用來實現的,外泌體正是其旁分泌的主要產物。外泌體是一種通過內體途徑分泌到細胞間隙的細胞外囊泡,直徑為30～100 nm,密度為1.13～1.19 g/mL,由Johnstone等首次在綿羊血清中分離發現,含有蛋白質、mRNA、miRNA、DNA等多種物質,目前發現T細胞、B細胞、血小板、間充質干細胞等均能夠分泌外泌體,血液、尿液、乳汁等體液中也均富含外泌體[4-5]。

2 ADSCs-Exo在傷口愈合中的作用

2.1 止血/炎癥期 在皮膚受損后,暴露的組織因子和膠原等會激活血小板聚集[6],釋放趨化因子和生長因子,在傷口形成凝塊以止血;另一方面,大量的細胞也被募集到傷口周圍。首先出現在損傷部位的是中性粒細胞,它浸潤傷口并通過釋放蛋白水解酶和氧自由基來清除細胞碎片和細菌以防止傷口感染[7],而后會以凋亡的方式被清除;之后,血液來源的單核細胞遷移至傷口部位并轉化為巨噬細胞,起到吞噬細菌、細胞殘體和壞死組織的作用[8],同時,吞噬細胞還會釋放大量的酶和細胞因子,刺激成纖維細胞和角化細胞從而促進血管生成。

在該階段,皮膚主要通過建立一種免疫屏障來防止外界微生物的入侵,而炎癥因子的水平是其中重要的因素之一。已有研究證明,ADSCs-Exo能夠顯著降低特應性皮炎小鼠中各種炎性細胞因子的表達,例如白介素(interleukin, IL)-4、IL-23、IL-31等[9]。此外,ADSCs-Exo還可以通過誘導神經酰胺的合成,顯著降低IL-5、腫瘤壞死因子α等炎癥細胞因子的水平,進而促進特異性皮炎的表皮屏障修復[10]。Cao等[11]在小鼠皮膚損傷模型中發現,ADSCs-Exo中的miR-19b可以通過調控趨化因子CC基序配體(chemokine CC motif ligands, CCL)/TGF-β軸信號通路,促進TGF-β1的表達以促進傷口的愈合。鞘氨醇1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)介導的信號通路在細胞的增殖和遷移、炎性因子的浸潤、血管生成等許多生理和病理過程中發揮重要作用。研究發現,ADSCs-Exo可以通過激活S1P/鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SK1)/鞘氨醇1-磷酸受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1, S1PR1)信號通路,促進巨噬細胞M2極化(M2是典型的抗炎類型[12]),從而發揮抗炎作用[13]。Zhao等[14]發現ADSCs-Exo處理可以增加巨噬細胞M2和IL-10的mRNA的表達,并通過其攜帶的活性信號傳感器和轉錄激活劑3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)激活精氨酸酶-1,從而誘導巨噬細胞向M2極化,抑制相關的炎癥反應。

由此可見,ADSCs-Exo可以通過調節炎癥因子的水平來達到抗炎、改善創面環境的效果,從而促進皮膚傷口的愈合。

2.2 增生期 該期可以分為3個階段。第一階段,傷口邊緣的成纖維細胞和角質形成細胞向愈合區遷移,成纖維細胞在傷口處增殖并產生基質蛋白纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅰ型及Ⅲ型前膠原[6,15],而膠原蛋白是傷口內細胞內基質形成的基礎。Hu等[16]發現,成纖維細胞可以將ADSCs-Exo吸收并內化,進而刺激細胞的遷移、增殖和合成,從而加快傷口的愈合。Zhang等[17]的實驗表明,ADSCs-Exo可以使膠原蛋白和基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP-1)的表達增加,并活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B, Akt)信號通路,而PI3K/Akt信號通路對ADSCs-Exo促進成纖維細胞的增殖和遷移具有重要作用;Choi等[18]通過實驗發現,ADSCs-Exo含有的miRNA可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的表達,從而刺激真皮成纖維細胞的增殖和遷移。此外,有學者通過細胞毒性試驗和細胞劃痕試驗證實,ADSCs-Exo也能顯著促進角質形成細胞的體外增殖和遷移[19]。

第二階段,內皮細胞對多種血管因子產生應答,其中包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)和成纖維生長因子(fibroblast growth factor, FGF),其中FGF和VEGF起主要調控作用[20]。近年來研究發現,ADSCs-Exo攜帶的miRNA(miR-126、miR-130a、miR-132、miR378a-3P)[21-22],不僅可以促進內皮細胞的增殖和遷移,還能通過增加血管內皮細胞中的VEGF、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)以及FGF等多種生長因子的水平而促進血管生成[23-24]。此外,Bai等[25]在小鼠皮瓣暴露導致的缺血/再灌注損傷模型中發現,ADSCs-Exo可以顯著增加皮瓣的存活率和毛細血管密度,減少皮瓣的炎癥反應和細胞凋亡,促進新生血管的形成。

第三階段,巨噬細胞、增殖的成纖維細胞和血管化的間質與膠原基質、纖維蛋白原、纖維連接蛋白的透明質酸一起構成臨時基質[15],并隨著膠原蛋白的積累,傷口處的肉芽組織逐漸成熟,鄰近的角化細胞作為上皮細胞遷移到傷口邊緣并完成上皮化。從宏觀角度來講,這一過程可以看作是大量肉芽組織的形成。有學者研究了ADSCs-Exo對角質形成細胞、成纖維細胞和內皮細胞的增殖和遷移的影響,發現ADSCs-Exo很容易被內皮化,從而促進這些細胞在體內的增殖、遷移和血管生成,更重要的是,ADSCs-Exo刺激了這些細胞中的Akt和細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, EPK)信號通路,在傷口局部注射ADSCs-Exo后,可顯著提高傷口再上皮化、膠原沉積和新生血管形成的能力,從而加速傷口的愈合[26]。

在傷口增生階段中,ADSCs-Exo能夠通過促進細胞的增殖、遷移和分化以及血管再生,幫助傷口完成上皮化,進而促進皮膚傷口的愈合。

2.3 重塑期 在增生期的基礎上,角化細胞從傷口邊緣轉移到臨時基質中并釋放細胞因子傳遞皮膚損傷的信息[27]。隨后,整合素和細胞骨架成分重新排列,肉芽組織停止生長,膠原蛋白的合成和分解以及細胞外基質的重塑不斷發生,成纖維細胞與細胞外基質相互作用,使傷口邊緣更加緊密[28]。傷口愈合后,成纖維細胞和巨噬細胞在細胞凋亡的作用下進一步減少[29],隨著時間推移,毛細血管不再生長,傷口部位的代謝活動減弱,最終形成完全成熟的瘢痕[30]。

2017年,Wang等[31]通過實驗發現,ADSCs-Exo可以通過激活MAPK絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/ERK通路,調節Ⅲ型膠原∶Ⅰ型膠原、TGF-27a3∶TGF-27a1、基質金屬蛋白酶3∶基質金屬蛋白酶抑制劑1(matrix metalloproteinases-1, TIP1)的比值,抑制成纖維細胞的分化,從而抑制肉芽組織的形成,最終實現皮膚傷口無疤痕修復。2019年,Ma等[32]的實驗發現,在H2O2誘導的損傷模型中,角質形成細胞HaCat經過H2O2處理后加入ADSCs-Exo,凋亡細胞明顯減少,說明ADSCs-Exo能夠顯著抑制細胞凋亡;Wnt蛋白/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路對調節皮膚傷口大小有著重要作用[33],進一步通過Western Blot實驗發現,ADSCs-Exo能夠提高β-catenin的表達,促進Wnt的分泌和運輸[34],從而促進創面愈合。He等[35]也發現,ADSCs-Exos可顯著降低H2O2對HaCat及人真皮成纖維細胞(human dermal fibroblasts, HDF)的增殖、遷移和凋亡的抑制作用。

在重塑期階段, ADSCs-Exo一方面可以通過調節膠原蛋白的比值抑制肉芽組織的形成,另一方面也可抑制細胞的凋亡,從而有助于傷口處組織的重建,實現傷口的無瘢痕愈合。

3 結語

總之,ADSCs-Exo在傷口愈合過程的不同階段均發揮著積極的作用。在止血/炎癥期,ADSCs-Exo能夠調節傷口各類炎癥因子的水平;在增生期,ADSCs-Exo可以促進血管的生成,促進傷口中各類細胞的增殖、遷移、分化;在傷口愈合的最后階段——重塑期,ADSCs-Exo還通過抑制肉芽組織的形成和細胞的凋亡,幫助傷口處組織的重建,最終完成傷口的愈合。因此,ADSCs-Exo有望成為促進難愈合傷口愈合的新型藥物。