綠豆C3H和NBS轉錄因子家族成員鑒定及鹽脅迫響應分析

劉金洋　林云　陳景斌　閆強　薛晨晨　吳然然　陳新　袁星星

摘要：NBS和C₃H是植物體內2個重要的轉錄因子家族，在調控植物抗病與耐鹽方面不可或缺。本研究通過轉錄組數據分析、qRT-PCR分析，分別鑒定出30個和289個綠豆C₃H和NBS家族成員，2個基因家族各有13個基因受到純化選擇，并且C₃H和NBS基因家族種內共線性關系均為片段重復。耐鹽材料的轉錄組數據分析結果表明，VrC₃H5、VrC₃H7、VrC₃H10和VrC₃H13等4個基因的表達量在鹽脅迫后發生顯著改變。VrC₃H5，VrC₃H7和VrC₃H13 3個基因對脫落酸（ABA）處理、氯化鈉（NaCl）處理、干旱脅迫都有不同程度的響應，VrC₃H5在ABA處理后基因表達量上調超過了10倍。在NBS基因中，有85個基因在鹽脅迫10 d和15 d后出現顯著差異表達，其中9個NBS基因表達變化值|log₂FC|（FC為表達倍數變化）大于2。VrNBS20轉錄因子通過調控EVM0022385參與綠豆的耐鹽功能，VrNBS20可能是綠豆抗病與耐鹽調控網絡中的交叉點。本研究結果為綠豆耐鹽與抗病研究提供了豐富的基因資源。

關鍵詞：綠豆；NBS基因家族；C₃H基因家族；鹽脅迫；VrNBS20轉錄因子

中圖分類號：Q786文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2023）05-1097-13

Identification and salt stress response analysis of mungbean C₃H and NBS transcription factor family membersLIU Jin-yang，LIN Yun，CHEN Jing-bin，YAN Qiang，XUE Chen-chen，WU Ran-ran，CHEN Xin，YUAN Xing-xing

（Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory of Efficient Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China）

Abstract：NBS and C₃H are two important transcription factor families in plants， which are indispensable in regulating plant disease resistance and salt tolerance. In this study， through transcriptome data analysis and qRT-PCR analysis， 30 and 289 mungbean C₃H and NBS family members were identified， respectively. Thirteen C₃H and 13 NBS genes were purified and selected， and the intraspecific collinearity analysis of C₃H and NBS gene families was fragment duplication. The transcriptome data analysis of salt-tolerant materials showed that the expression levels of VrC₃H5， VrC₃H7， VrC₃H10 and VrC₃H13 were significantly changed after salt stress. VrC₃H5， VrC₃H7 and VrC₃H13 had different degrees of response to abscisic acid （ABA） treatment， sodium chloride （NaCl） treatment and drought stress. The expression of VrC₃H5 was up-regulated by more than 10 times after ABA treatment. A total of 85 NBS genes were significantly differentially expressed after 10 days and 15 days of salt stress， of which nine NBS genes had a change in expression value |log₂FC| （FC was the expression fold change） greater than two. VrNBS20 was involved in the salt tolerance function of mung bean by regulating EVM0022385， and VrNBS20 may be the intersection point in the disease resistance and salt tolerance regulatory network of mungbean. The results of this study provide abundant genetic resources for the study of salt tolerance and disease resistance of mungbean.

Key words：mungbean;NBS gene family;C₃H gene family;salt stress;VrNBS20 transcription factor

綠豆 （Vigna radiata L.），屬于豆科豇豆屬，含有22條染色體[1]。作為功能性食品原料，綠豆籽粒富含蛋白質、多種人體必需氨基酸、碳水化合物、膳食纖維及生物活性物質。隨著人們生活水平的提高和對健康飲食的需求，綠豆的高營養價值開始被人們重視，綠豆的需求量逐漸增大[2]。然而，鹽脅迫與病害嚴重制約著溫帶、亞熱帶及熱帶地區綠豆的生產，尤其以印度、中國、泰國、緬甸和菲律賓等國家為代表。挖掘抗性基因并應用于抗性育種已成為主要農作物抗性育種的主要方法之一。目前，在挖掘綠豆抗性基因方面的研究還不是很深入，有關綠豆耐鹽相關的全基因組關聯分析和遺傳定位的研究還很少。轉錄因子作為植物的內在調控因子，在植物應對非生物與生物脅迫中具有重要的調控作用。因此，利用比較基因組學挖掘、鑒定綠豆抗病與鹽脅迫響應的轉錄因子對綠豆的遺傳改良至關重要。

NBS（Nucleotide binding site）和C₃H（CCCH）是植物體內2個重要的轉錄因子家族，具有獨特的功能和結構，在調控植物的抗病與耐鹽信號轉導方面起重要作用[3-5]。NBS轉錄因子家族是植物中大轉錄因子家族之一，含有TIR、NBS和 LRR等結構域。NBS結構域主要介導下游信號轉導[6]，LRR結構域主要介導蛋白質之間的互作。根據轉錄因子N端是否含有TIR結構域將其分為兩個亞類[7]。一類為含有TIR-NBS-LRR結構域的TNL型；另一類R基因編碼的蛋白質通常被CC（Coiled-Coil）替代，又稱CC-NBS-LRR（CNL）型[8]。植物體內NBS基因的數量從幾十個到上千個不等[8-10]。同時，NBS基因組成的不同會導致植物對病原體抗性形成差異[11]。NBS基因通常包含各種類型的重復，這些重復對NBS基因的功能有著重要影響[12]。NBS轉錄因子基因已被證明在花生青枯病、大豆花葉病、番茄菟絲子、葡萄霜霉病抗性調控中起著重要作用[13-17]。NBS轉錄因子基因在植物非生物脅迫中的研究還較少，挖掘具有抗逆和抗病作用的多功能轉錄因子基因對綠豆的抗病和耐逆育種至關重要。

C₃H家族轉錄因子屬于鋅指蛋白，包含1～6個CCCH結構，主要含有3個半胱氨酸和1個組氨酸殘基[18-19]。含有C-X_7-8-C-X₅-C-X₃-H基序的C₃H蛋白是最大的一類C₃H轉錄因子[20-21]。C₃H基因家族參與植物發育和逆境適應等過程，在激素調節下對植物的生長起重要作用。在水稻中，OsDOS（C₃H基因）參與茉莉酸（JA）代謝，過表達該基因能顯著延緩葉片衰老[22]。在擬南芥中，C₃H14和C₃H15基因能夠調節花藥發育和雄性育性[23]。此外，一些C₃H鋅指蛋白還參與植物的非生物脅迫反應。ZFP1通過維持細胞中離子平衡來調節滲透脅迫，提高植物的耐鹽性。C₃H型鋅指蛋白基因AtSZF1和AtSZF2能夠正向調控擬南芥的耐鹽性[24]。過表達C₃H18后，甘薯對干旱和高鹽環境的抗性顯著增強[25]。在水稻中，zfp5突變體在鹽脅迫和滲透脅迫下，萌發率、主根長、脯氨酸含量、葉綠素含量及活性氧清除酶的活性顯著小于野生型，而ZFP5基因過表達株系在鹽脅迫和滲透脅迫下，萌發率、主根長、脯氨酸含量、葉綠素含量及活性氧清除酶的活性顯著大于野生型[26]。

轉錄因子在非生物脅迫調控中具有重要作用， WRKY、MYB、C₃H和HDzip型轉錄因子含有相應的順式作用元件可以介導ABA響應基因的表達，他們在多種植物鹽脅迫逆境下被誘導[27]。此外，水稻ERF1轉錄因子能夠與ABA信號通路下游OsABI5基因啟動子結合，抑制其表達，增強水稻種子在鹽脅迫下的萌發率[28]。上述研究結果表明包括轉錄因子在內的ABA合成表達調控基因在植物非生物逆境的響應與適應方面發揮了重要的作用。

目前，有關綠豆NBS和C₃H基因家族成員組成、序列及進化特征，與鹽脅迫響應相關的NBS和C₃H候選基因還缺乏研究。本研究以江蘇省農業科學院經濟作物研究所保存的蘇綠1號為材料，鑒定綠豆NBS和C₃H基因家族成員，分析NBS和C₃H基因家族成員堿基序列及進化特征，并挖掘鹽脅迫響應相關的NBS和C₃H候選基因，為綠豆的抗病與耐鹽育種提供基因資源。

1材料與方法

1.1植物材料和處理

本研究使用的綠豆品種為江蘇省農業科學院經濟作物研究所保存的蘇綠1號，將其種植于28 ℃恒溫溫室，16 h光期、8 h暗期培養7 d后分別用20％的PEG6000、100 μmol/L的脫落酸（ABA）和100 mmol/L的鹽（NaCl）溶液對幼苗進行脅迫處理，以無脅迫為對照，在處理0 h、4 h、12 h、24 h、48 h后隨機選取不同處理幼苗5株，取根部組織約0.1 g，進行qRT-PCR分析。

選取2個耐鹽材料A1和A3及2個不耐鹽材料C1和C2[29]，幼苗出芽后第10 d，分別用100 mmol/L鹽溶液處理，鹽處理后10 d與15 d取上述材料的葉片用以轉錄組分析，分析NBS和C₃H家族基因在鹽脅迫下表達變化。

1.2綠豆NBS和C₃H基因家族成員篩選、保守基序和進化樹分析首先，從網站https：//www.arabidopsis.org 和https：//www.researchgate.net/publication/347076195_high-quality_genome_assembly_annotation_and_evolutionary_ analysis_of_the_mungbean_Vigna_radiata_genome下載擬南芥NBS和C₃H蛋白氨基酸序列和綠豆基因組編碼的蛋白質序列，利用NCBI blast軟件進行序列比對，設置E-value為1×10^-100，篩選得到綠豆NBS和C₃H候選基因。其次，利用pfam網站（http：//pfam-legacy.xfam.org）分析上述候選基因編碼蛋白質的保守結構域，去除編碼蛋白質中不含C-X_7-8-C-X₅-C-X₃-H和TIR、NBS、LRR結構域的候選基因。隨后利用MEME軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）和MEGA7軟件，采用Neighbor-Joining法，迭代1 000次，對NBS和C₃H家族基因進行進化樹分析，再利用TBtools軟件對NBS和C₃H家族基因進行保守基序的聚類分析[30]。

1.3NBS和C₃H家族基因染色體定位、啟動子和共線性分析利用TBtools軟件的GFF3/GTF Gene Position（Info.） Parse模塊獲取上述候選基因在染色體上的位置。利用PlantCARE網站分析C₃H基因家族成員上游啟動元件（5′上游選2 000 bp），篩選與植物逆境響應相關的元件，并進行可視化作圖。根據擬南芥與綠豆NBS和C₃H基因家族成員的序列，分析NBS和C₃H家族物種間共線性特點。同時，采用TBtools軟件對綠豆NBS和C₃H家族物種內共線性特點進行分析，并估算共線性基因的非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks），以Ka/Ks值估測基因家族在進化過程中受到的選擇壓力。

1.4綠豆NBS和C₃H基因家族成員在鹽脅迫下表達變化分析使用FlaPure Plant Total RNA Extraction Kit試劑盒（北京金沙生物科技有限公司產品）提取綠豆根部總RNA。使用UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR with dsDNase （北京金沙生物科技有限公司產品） 反轉錄合成綠豆cDNA。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑（南京諾唯贊生物股份有限公司產品）及ABI prism 7500 real-time PCR System （Thermo Fisher公司產品，美國）進行qRT-PCR分析。PCR擴增程序為：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，40個循環。基因特異性引物設計采用 Primer 5 軟件，使用的內參基因為VrACTIN3 （Vradi03g00210）[29]，具體引物信息見表1。每個基因表達量檢測設置3個重復。

綠豆NBS和C₃H基因家族候選基因相對表達量分析采用 2^-△△Ct計算方法，采用FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）計算方法分析轉錄組數據[31]。使用SPSS軟件中的t檢驗法對基因表達水平進行差異顯著性分析。

1.5差異轉錄因子調控基因的預測

將差異表達顯著的C₃H和NBS轉錄因子氨基酸序列上傳至網站https：//www.string-db.org進行轉錄因子調控基因預測，設置顯著作用值為0.40，分析轉錄因子顯著調控的基因，利用cytoscape軟件對結果進行可視化作圖。

2結果與分析

2.1綠豆C₃H和NBS基因家族成員分布

通過NCBI blast比對及MEME、pfam網站保守基序分析，在綠豆全基因組共篩選得到30個C₃H基因（表2），289個NBS基因。30個C₃H基因主要分布在1號、3號、5號、6號、8號染色體上，10號染色體沒有C₃H基因，9號染色體僅有1個C₃H基因EVM0029904.1，1號、3號和8號染色體上分別有5個C₃H基因（圖1a）。289個NBS基因主要分布在1號、7號、8號、9號和10號染色體上，4號和6號染色體分別有7個和5個NBS基因（圖1b），另有14個NBS基因分布在重疊群上。

2.2C₃H和NBS基因家族進化樹及保守結構分析

C₃H和NBS基因家族進化樹分析結果顯示，C₃H家族分為3個分支（圖2a），位于同一分支的基因具有較高的同源性和保守型。C₃H基因家族不同分支保守基序差異性較大，分支Ⅰ9個基因，含有2種保守基序（基序1和基序2）；分支Ⅱ7個基因，含有保守基序4；分支Ⅲ 14個基因，含有保守基序3（圖2b、圖2c）。NBS基因家族分為兩個分支，分支Ⅰ含有成員數為155；分支Ⅱ含有成員數為134（圖3）。兩分支保守基序差異性較小。雖然NBS基因家族所含的保守結構相似，但是這些基因的堿基序列長度差異性較大。在位于11條染色體上的275個基因中，分支Ⅰ基因的平均長度為3 381.5 bp，分支Ⅱ基因的平均長度為4 070.9 bp，分支Ⅰ和分支Ⅱ成員在基因堿基序列長度方面差異較大，說明NBS基因家族的功能多樣性。

C₃H基因家族成員上游2 000 bp堿基序列除了具有光響應、逆境和無氧響應元件外，還具有多種植物激素（茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸及ABA等）響應元件（圖2d）。其中有12個C₃H基因的啟動子區域存在ABA響應元件，14個C₃H基因啟動子區域存在茉莉酸甲酯響應元件，12個C₃H基因的啟動子區域存在赤霉素響應元件，14個C₃H基因啟動子區域存在干旱脅迫響應元件[MBS（CAACTG）]。這些結果說明C₃H基因家族與植物的生長發育以及響應逆境有關，這種特征在其他植物中亦有體現[24]。

2.3綠豆和擬南芥C₃H與NBS基因家族之間共線性分析綠豆和擬南芥C₃H、NBS基因家族共線性分析結果顯示，綠豆C₃H基因家族和NBS基因家族分別有18個基因和7個基因與擬南芥基因具有共線性（圖4a、圖4b）。這說明C₃H基因家族在基因序列上具有較高的保守性，而NBS基因家族在基因序列上差異性較大，表明其功能可能具有多樣性。

基因組內的共線性分析結果表明，分別有13個C3H基因和13個NBS基因存在共線性（圖4c、圖4d）。C3H共線性基因占所有成員的43.3%；NBS共線性基因僅占所有成員的4.5%，即NBS基因組內部共線性較差。上述的共線性關系均為片段重復（表3），并且這些基因共線性關系的Ka/Ks值（非同義替換率/同義替換率）均小于1，說明他們均受到純化選擇。

2.4C₃H和NBS家族基因鹽脅迫下表達特性分析

有85個NBS基因在鹽處理10 d后存在顯著差異表達，占總家族成員的29.41%；141個NBS基因在鹽處理15 d后存在顯著差異表達，占總家族成員的48.79%；有85個基因在鹽處理10 d和15 d后均出現顯著差異表達。在這85個差異表達基因中，有59個基因 的|log₂FC|值（FC為差異倍數）大于0.5（圖5A），其中46個基因的表達上調，13個基因的表達下調。此外，VrNBS20（EVM0031127.1）、VrNBS134（EVM0032953.1）、VrNBS135（EVM0022303.1）、VrNBS196（EVM0032738.1）、VrNBS167（EVM0033726.1）、VrNBS173（EVM0033029.1）、VrNBS213（EVM0000182.1），VrNBS208（EVM0007891.1）和VrNBS223（EVM0033901.1）等9個基因表達變化幅度較大（|log₂FC|>2）。C₃H基因家族中有4個C₃H基因在鹽處理10 d后存在顯著差異表達，占總家族成員的13.33%。9個C₃H基因在鹽處理15 d后存在顯著差異表達 （圖5B），占總家族成員的40.00%。其中，VrC₃H5（EVM0017299.1）、VrC₃H7（EVM0019299.1）、VrC₃H10（EVM0018432.1）和VrC₃H13（EVM0024653.1）4個基因表達水平變化幅度較大。

4個表達水平差異較大的C₃H基因VrC₃H5、VrC₃H7、VrC₃H10和VrC₃H13在ABA、NaCl、PEG6000處理后的相對表達量變化如圖5C所示。VrC₃H5、VrC₃H7和VrC₃H13 3個基因對ABA、NaCl、PEG6000處理有不同程度的響應。VrC₃H5對ABA響應較為明顯，處理4 h后達到最高值，其表達量變化超過10倍，之后出現下降。VrC₃H7在ABA處理后4 h表達量達到最高值，之后出現下降；在NaCl、PEG6000處理后VrC₃H7表達量下降顯著。VrC₃H13在ABA處理后的4 h表達量達到最高值，之后大幅下降，48 h后表達量恢復正常。

2.5差異轉錄因子調控基因及其互作

在顯著作用值>0.4時，有2個C₃H差異轉錄因子調控基因。其中，VrC₃H5調控EVM0001847、EVM0020938和EVM0032843基因，且EVM0001847、EVM0020938和EVM0032843這3個基因之間存在顯著互作關系（圖6A）；VrC₃H7調控EVM0019967、EVM0006240、EVM0021757和EVM0031747基因，其中EVM0031747與EVM0021757、EVM0019967與EVM0006240存在顯著互作關系（圖6B）；NBS家族中僅有VrNBS20調控EVM0022385基因，而EVM0022385與另外9個基因存在顯著互作關系（圖6C）。

在C₃H轉錄因子調控的7個基因中，EVM0001847、EVM0032843和EVM0021757在鹽處理后出現顯著差異表達（圖6D）。其中，EVM0001847基因表達量極顯著上調。NBS轉錄因子調控的基因僅EVM0022385，但有5個基因在鹽處理后與EVM0022385一樣出現顯著差異表達。其中EVM0009188基因表達量極顯著上調（圖6D）。

3討論與結論

3.1VrC₃H5、VrC₃H7和VrC₃H10基因參與干旱脅迫的響應從低等植物萊茵衣藻到高等植物擬南芥、水稻、玉米等都普遍存在C₃H基因[32-34]。C₃H型鋅指蛋白在調節植物發育和脅迫響應中起著重要作用。過表達水稻OsC₃H38基因能顯著提高轉基因水稻的耐鹽性，改善水稻的生理指標[32]；鹽脅迫會引起擬南芥AtZFP1的表達量上調，過表達AtZFP1基因能顯著提高NaCl處理下擬南芥的發芽率和出苗率[24]。在植物應對鹽脅迫的代謝過程中，C₃H等轉錄因子發揮著重要的調節功能[35]，挖掘綠豆耐鹽相關的C₃H基因對綠豆的耐鹽遺傳改良至關重要。植物主要通過ABA信號途徑應對外界鹽脅迫［36-38］，例如，在擬南芥中發現鹽脅迫誘導的類胡蘿卜素合成，能夠提供豐富的ABA前體以確保ABA合成，增強植株的耐鹽性[35]。水稻細胞壁纖維素合酶類蛋白OsCSLD4可以增強水稻ABA合成基因的表達，提高水稻耐鹽性[39]。

本研究通過序列比對和系統發育樹分析，發現30個C₃H家族成員可劃分成3個亞家族，同一亞家族的基序分布模式基本一致，如I亞家族都具有相同的3個基序，不同亞家族之間基序數量差異較大。這3個亞家族基因在進化過程中均存在片段復制現象，并且均受到純化選擇。C₃H家族成員啟動子區域均存在干旱脅迫響應元件。

在耐鹽轉錄組數據分析中，發現VrC₃H5、VrC₃H7、VrC₃H10和VrC₃H13 4個基因變化幅度較大，同時在鹽處理15 d后仍存在顯著差異表達。這4個基因對鹽處理較敏感，可能是與鹽脅迫響應相關的候選基因。

在候選基因的qRT-PCR分析中，VrC₃H5在ABA處理后的4 h后表達量達到最高值，表達量變化超過10倍。VrC₃H7在ABA處理后的4 h后表達量達到最高值，是對照組的3倍。VrC₃H10在ABA處理后的24 h后表達量達到最高值，是對照組的11倍，之后出現下降。在PEG6000和NaCl處理后VrC₃H5、VrC₃H7和VrC₃H13 3個基因的表達量均出現下降，而VrC₃H10基因的相對表達量沒有顯著變化。

轉錄因子調控基因分析結果表明VrC₃H5和VrC₃H7參與了耐鹽調控網絡。VrC₃H5、VrC₃H7和VrC₃H10基因對鹽脅迫的響應情況和轉錄組分析的結果較為一致，表明鹽脅迫影響了這些基因的表達。

3.2綠豆VrNBS20可能同時具有抗病和耐鹽功能

NBS基因家族在大豆花葉病、葡萄霜霉病、小麥葉銹病等植物病害的抗性調控中具有重要作用[40]。NBS基因是否還參與耐鹽調控值得探索。

為了挖掘鹽脅迫響應的NBS基因，研究發現有85個NBS基因在鹽處理10 d和15 d后均出現顯著差異表達。在這85個差異表達基因中，有59個基因鹽處理后15 d表達變化值|log₂FC|>0.5；9個NBS基因鹽處理后15 d表達變化值|log₂FC|>2.0。對這些基因的抗病性能還需要進一步分析。

在候選基因的互作網絡分析中僅發現1個NBS轉錄因子（VrNBS20）調控EVM0022385基因。同時，VrNBS20的功能注釋為抗煙草花葉病毒蛋白N，而與其同源的擬南芥AT5G17680基因編碼的蛋白質對flg22病原菌具有免疫應答作用[41]。與EVM0022385互作的10個基因中有5個基因在鹽處理后出現顯著差異表達。這5個基因中EVM0009188的表達量在鹽處理后出現顯著上調，其他4個基因表達量顯著下調。說明，VrNBS20可能不僅具有抗病的活性，同時還參與綠豆的耐鹽調控。

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（責任編輯：石春林）