非洲豬瘟病毒無標簽p35蛋白的制備及間接ELISA抗體檢測方法的建立

吳植　盧會鵬　王安平　謝軍　曹世諾　徐艷　朱善元

摘要：為了進一步提高非洲豬瘟病毒（ASFV）間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）抗體檢測方法的特異性，本研究構建了類彈性蛋白（ELP）標簽與ASFV p35融合表達載體，利用相變循環分離純化融合蛋白后，用煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）切除ELP標簽，制備獲得無標簽p35蛋白，以此為包被抗原，通過一系列的條件摸索和優化，建立ASFV間接ELISA抗體檢測方法。結果顯示，ELP-p35融合蛋白的相對分子質量大小約為80 000；制備獲得的無標簽p35蛋白能夠被非洲豬瘟陽性血清所識別；抗原包被最佳質量濃度為2.00 μg/ml，待檢血清最佳稀釋比例為1∶200，二抗最佳稀釋比例為1∶10 000，陰性和陽性判定閾值OD₄₅₀為0.171；與口蹄疫病毒（FMDV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和偽狂犬病毒（PRV）等陽性血清無交叉反應，特異性好；批內、批間試驗結果顯示變異系數都小于5.000%，重復性好；可檢測400倍稀釋的血清，敏感性較高；與商品化檢測試劑盒（ING）檢測結果的符合率高達100%。結果表明，用本研究制備的ASFV無標簽p35蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法可用于ASFV抗體的檢測，為該病的進一步精準檢測提供了技術手段。

關鍵詞：非洲豬瘟；類彈性蛋白；無標簽p35蛋白；間接ELISA方法

中圖分類號：S852.65+1 文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2023）05-1209-08

Preparation of tag-free p35 of African swine fever virus and development of an indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） antibody detection methodWU Zhi，LU Hui-peng，WANG An-ping，XIE Jun，CAO Shi-nuo，XU Yan，ZHU Shan-yuan

（Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Key Laboratory for High-Tech Research and Development of Veterinary Biopharmaceuticals/Engineering Technology Research Center for Modern Animal Science and Novel Veterinary Pharmaceutic Development， Taizhou 225300， China）

Abstract：To further improve the specificity of indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） method for detection of African swine fever virus （ASFV） antibody， fusion expression vector containing elastin-like polypeptide （ELP） tag and ASFV p35 was constructed. After separating and purifying the fusion protein by inverse transition cycling， the tag-free p35 protein was obtained by cutting off the ELP tag by tobacco etch virus protease （TEVP）. Using the purified recombinant protein as coating-antigen， the study aimed to establish an indirect ELISA method for detecting ASFV antibody through a series of condition exploration and purification. The results showed that， the relative molecular mass of ELP-p35 fusion protein was 80 000， and the obtained tag-free p35 protein could be recognized by positive serum of ASFV. It was found that the optimum antigen coating mass concentration was 2.00 μg/ml， the optimum dilution rate for sera to be tested was 1∶200， the optimum dilution rate for HRP-IgG was 1∶10 000， and the cut-off value of OD₄₅₀was 0.171. The method showed no cross-reaction with positive sera of foot-and-mouth disease virus （FMDV）， porcine circovirus type 2 （PCV2）， porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， classical swine fever virus （CSFV） and pseudorabies virus （PRV）， which showed high specificity. Coefficients of variation of the intra- and inter-assay were both <5.000% and showed good repeatability. Besides， the method could detect serum diluted 400 times， which showed high sensitivity. Compared with commercialized detection kits （ING）， the coincidence rate of testing results of tag-free p35-ELISA method was 100%. The results indicated that the established indirect ELISA method by using tag-free p35 protein as coating antigen of ASFV can be applied in detection of ASFV-specific antibodies， which can provide technological tool for accurate detection of ASFV.

Key words：African swine fever;elastin-like polypeptide;tag-free p35 protein;indirect ELISA

江蘇農業學報2023年第39卷第5期吳植等：非洲豬瘟病毒無標簽p35蛋白的制備及間接ELISA抗體檢測方法的建立非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染可引起家豬和野豬高熱和全身性出血，是一種高度接觸性傳染病，各種年齡家豬均易感，病死率可達100%[1]。非洲豬瘟病毒最早于1921年在肯尼亞發現，隨后蔓延至西歐、拉美等國家和地區[2]。2018年8月首次傳入中國，并迅速擴散于國內多個地區，給生豬養殖業造成了嚴重的經濟損失[3-4]。

ASFV呈20面體對稱，其基因組為雙股DNA分子，全長170～194 kb，編碼150～200個蛋白質，大部分為結構蛋白質，目前仍有一半以上的蛋白質功能尚不清楚[5-7]。除結構蛋白質外，病毒具有完整的酶系統[8]、編碼免疫逃逸相關的蛋白質[9]、能夠吸附紅細胞 [10-11]、侵害單核-巨噬細胞[12]等特點，以上病原學特點和感染特性給非洲豬瘟（ASF）的疫苗研制帶來巨大挑戰，至今尚無有效的疫苗問世。ASF的防控以病原檢測和撲殺為主。經過長時間的傳播和流行，ASFV在中國發生了不同形式的變異，出現了自然弱毒株與強毒株同時存在的新情況，致使感染豬出現超長潛伏期感染，給非洲豬瘟的精準剔除或“拔牙”增加了困難。因此監測 ASFV感染抗體成為早期發現 ASF 的重要手段之一。研究結果表明，由ASFV CP530R基因編碼的pp62蛋白具有較高的免疫原性[13]，感染豬后會產生較高水平的pp62抗體，通過間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測pp62抗體能夠快速準確地檢測感染豬的情況。多聚蛋白pp62在病毒顆粒成熟過程中，被S273R蛋白酶水解切割為p15和p35 2個主要蛋白質[14]，p35的釋放是病毒顆粒成熟的重要標志[15]。

類彈性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）是一種五肽聚合物，具有對溫度敏感、可逆相變特性，可作為純化標簽實現外源蛋白質的純化[16]。本研究將p35蛋白與ELP融合表達，利用可逆相變特性獲得純化蛋白質。為了減少假陽性，用煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）切除ELP，獲得無標簽可溶性p35蛋白，建立間接ELISA檢測方法，為ASFV病毒抗體精準檢測提供了有效的技術手段。

1材料與方法

1.1材料

感受態細胞BL21（DE3）與 PCR產物回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，DNA質粒提取試劑盒購自安諾倫（北京）生物科技有限公司，連接酶、限制性內切酶和 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白質凝膠配制試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。ASFV標準陽性血清購自國家獸醫微生物菌（毒）種保藏中心，商品化抗體檢測試劑盒購自西班牙英吉納公司。原核表達載體pET-ELP由本實驗室構建并保存。

1.2引物設計

參照pUC-pp62序列，設計上下游引物，上游引物序列（F）為：5′-AAGAAGGAGATATAGGTGAGCTCCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAACGACCCCCCCGTGCCCAA-3′，下游引物序列（R）為： 5′- GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAACCTTCTCCTCGGGGAT-3′。斜體處分別是Sac Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點序列，加粗處為TEVP酶切位點序列，引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.3pELP-p35融合表達載體的構建與鑒定

以p35重組質粒為模板進行PCR擴增，回收p35基因片段。PCR擴增體系為30 μl：p35重組質粒1 μl，上下游引物各1 μl，2×PrimeSTAR Max Premix 15 μl，ddH₂O 12 μl。PCR反應程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72 ℃ 2 min。用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ分別雙酶切pET-ELP與p35基因片段，4 ℃過夜連接回收產物，轉化，提取陽性質粒進行雙酶切鑒定。

1.4ELP-p35融合蛋白的誘導表達與可逆相變循環（ITC）純化將pELP-p35轉化BL21（DE3），在營養瓊脂平板（含50 μg/ml卡那霉素）上37 ℃培養過夜；挑取單克隆接種于5 ml LB培養基（50 μg/ml卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min過夜培養活化；將重組菌液按體積比1∶100接種于200 ml 2×YT培養基（50 μg/ml卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min培養至OD600約為0.6～0.8時，加入0.2 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），20 ℃ 180 r/min過夜誘導，同時設置對照；誘導結束后用超聲波破碎儀將菌液破碎10 min，直至液體清亮；將破碎后的菌液于4 ℃、8 000 r/min離心8 min，分別收集上清液、沉淀，沉淀用等量磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮，各取10 μl進行SDS-PAGE電泳。在重組菌破碎離心的上清液中加入6 mol/L NaCl溶液，在22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃孵育10 min，12 000 g離心10 min，分別取沉淀制樣，進行SDS-PAGE分析，根據蛋白質條帶大小確定ITC最佳溫度；在重組菌上清液中分別加入不同濃度的氯化鈉溶液至終濃度為1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L和3.0 mol/L，28 ℃孵育10 min，28 ℃、12 000 g離心10 min，用300 μl TEVP反應液重懸沉淀，進行SDS-PAGE分析，根據蛋白質條帶含量大小確定可逆相變循環（ITC）純化的氯化鈉最佳濃度。

1.5無標簽p35蛋白的制備與鑒定

純化ELP-p35融合蛋白的相變循環參照文獻[17]的方法進行，將重組菌裂解液與等量6 mol/L NaCl混勻，28 ℃孵育10 min，室溫下12 000 g離心5 min，沉淀用TEVP溶液重懸，4 ℃孵育30 min，4 ℃、12 000 g離心10 min，收集上清液，取上清液10 μl進行SDS-PAGE電泳分析。標簽ELP切割參考Li等[18]的方法進行，蛋白酶用量為100 μg/ml，30 ℃孵育36 h；4 ℃、16 000 g離心10 min；與等量6 mol/L NaCl混合，28 ℃孵育10 min；室溫下14 000 g離心5 min，離心后的上清液用PBS（pH 7.2）透析2次，每次2 h，4 ℃、14 000 g離心10 min，收集上清液即為純化無標簽重組p35蛋白。將切割回收的蛋白質通過SDS-PAGE分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，封閉后加入體積比1∶200稀釋的ASFV抗體陽性血清孵育2 h，用含有吐溫20（Tween-20）的Tris鹽緩沖液（TBST）洗滌4次，加入羊抗豬IgG二抗反應45 min，TBST洗膜4次后，滴加超敏發光液并置于化學發光儀內曝光。

1.6間接ELISA方法的建立

1.6.1抗原最適質量濃度與血清最佳稀釋度的確定采用棋盤滴定方法，將不同質量濃度（8.0 μg/ml、4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、 1.0 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml）的p35包被到酶標板中，每孔100 μl，4 ℃過夜；用 TBST洗滌4次，用5%脫脂牛奶封閉1 h；按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋倍比加入標準陰性血清、標準陽性血清，每孔100 μl，37 ℃? 1 h，洗滌4次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗豬IgG（1∶10 000），37 ℃孵育30 min后洗滌；加入四甲基聯苯胺（TMB）顯色反應10 min；用50 μl稀硫酸終止反應，測定OD₄₅₀；以標準陽性血清OD₄₅₀接近1，陽性血清OD₄₅₀與陰性血清OD₄₅₀的比值（P/N值）最大的孔蛋白質包被質量濃度和血清稀釋度作為最適包被質量濃度和血清最佳稀釋度。

1.6.2其他反應條件的優化以優化的最佳抗原包被質量濃度和血清稀釋度，對包被液（去離子水、0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液、pH 7.2 PBS、0.05 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液）、封閉液[5%卵清蛋白（OVA）、5%脫脂牛奶、5%牛血清白蛋白、1%明膠、1%海藻糖]、血清稀釋液（1%脫脂牛奶、3%脫脂牛奶、5%脫脂牛奶）、酶標抗體稀釋度（1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000、1∶40 000）和底物顯色時間（5 min、10 min、15 min、20 min）等條件進行優化，每個反應設置3個重復孔，測定OD₄₅₀，取其平均值。

1.6.3陰性與陽性標準臨界值的確定以優化后的p35-ELISA檢測條件對已知143份陰性血清進行檢測，計算OD₄₅₀平均值（x—）和標準差（SD），當OD₄₅₀大于等于x—＋3SD時判定為陽性；小于x—＋3SD時判定為陰性。

1.6.4特異性試驗按照最優的檢測條件，對口蹄疫病毒（FMDV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和偽狂犬病毒（PRV）等抗體陽性血清進行特異性檢測，同時設置標準陰性血清對照和標準陽性血清對照，3次重復，測定OD₄₅₀，取平均值，判斷是否存在非特異性交叉反應，判定特異性。

1.6.5重復性試驗按照最優的檢測條件，用相同批次及不同批次制備的無標簽p53蛋白作為包被抗原檢測6份血清，其中陽性血清5份，陰性血清1份，每個樣品重復3孔，測定OD₄₅₀，取其平均值，計算批內試驗和批間試驗變異系數，分析重復性。

1.6.6敏感性試驗在最優條件下，將標準陽性血清進行倍比稀釋800倍，并設置陰性對照，根據檢測結果判定評價ELISA方法的靈敏度。

1.6.7臨床樣品的檢測應用建立的p35間接ELISA抗體檢測方法對實驗室保存的103份臨床血清樣品進行檢測，并與INGENASA公司ASFV抗體檢測試劑盒的檢測結果進行比較，計算符合率。

2結果與分析

2.1ASFV p35基因的擴增

從模板擴增特異性p35基因片段，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段的大小為915? bp，主要包含CP530R基因序列C端的478～1 383 bp、酶切位點序列、煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）酶切位點序列和保護性堿基等，與預期大小一致，結果見圖1。

2.2融合表達載體的鑒定

將p35基因片段定向克隆至pET-ELP，構建融合重組表達質粒pET-ELP-p35，經過Sac Ⅰ+Xho Ⅰ雙酶切后，獲得預期大小的2個片段，即951 bp和6 912 bp，表明重組質粒pET-ELP-p35構建正確，結果見圖2。

2.3融合蛋白的表達與ITC純化

SDS-PAGE凝膠電泳結果（圖3）顯示，重組菌出現相對分子質量為80 000的蛋白質條帶，與預期大小相符，且在上清液中獲得表達。ELP-p35融合蛋白ITC的最佳孵育溫度為28 ℃（圖4）。ITC純化的最佳NaCl濃度為4 mol/L（圖5）。

2.4無標簽重組p30蛋白純化與免疫印跡鑒定

將煙草蝕紋病毒蛋白酶按一定比例加入純化的ELP-p35融合蛋白溶液中，在水浴鍋中30 ℃孵育切割ELP標簽，12 000 r/min 離心10 min去除TEVP，在上清液中加入對應體積的4 mol/L NaCl，28 ℃孵育10 min，12 000 r/min 離心10 min，將上清液透析至PBS（pH 7.2），SDS-PAGE分析結果（圖6）顯示，經純化后獲得可溶性無標簽p35重組蛋白。用非洲豬瘟抗體陽性豬血清通過免疫印跡鑒定（Western Blot）檢測重組p35蛋白，結果顯示切割后的p35重組蛋白能被非洲豬瘟抗體特異性識別（圖7）。

2.5間接ELISA條件的確定

2.5.1重組蛋白質包被質量濃度和待檢樣品稀釋度的確定通過方陣滴定試驗可知，當無標簽p35蛋白包被質量濃度為2.00 μg/ml，待檢血清按1∶200稀釋時，此時P/N值（1.514/0.091）最大，且此時陽性血清OD₄₅₀>1，所以確定2.00 μg/ml為最適包被質量濃度，血清最適稀釋比例為1∶200（表1）。

2.5.2其他條件的優化根據P/N值的大小確定包被液為0.05 mol/L、 pH 9.6碳酸鹽緩沖液，封閉液為5%脫脂牛奶，血清稀釋液為5%脫脂牛奶，二抗稀釋比例為1∶10 000，3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色時間為10 min。

2.5.3臨界值的確定在最優化條件下，對已知的143份陰性血清進行檢測，同時設置已知的ASFV抗體陽性樣品作為對照，陰性血清樣本OD₄₅₀的平均值（x—）為0.081，標準誤（SD）為0.03，則血清陰性和陽性判定閾值OD₄₅₀為0.171，即待測血清OD₄₅₀＞0.171 為陽性，待測血清OD₄₅₀≤0.171為陰性。

2.5.4批內、批間重復試驗批內重復試驗結果（表2）顯示，變異系數為0.348%～3.757%；批間重復試驗結果顯示，變異系數為0.320%～2.040%，變異系數均小于5.000%，表明建立的ELISA方法重復性良好。

2.5.5敏感性試驗在最優條件下，對倍比稀釋的標準陽性血清進行ELISA抗體檢測，結果顯示，當按1∶400稀釋時OD450＞0.171，說明該方法有較好的靈敏度。

2.5.6特異性試驗在優化條件下，檢測CSFV、PRRSV、FMDV、PCV2和PRV的陽性血清，結果（表3）顯示，建立的以p35為包被抗原的檢測結果均為陰性，表明該方法特異性好。

2.5.7臨床樣品的檢測利用本研究建立的p35間接ELISA抗體檢測方法與商品化非洲豬瘟抗體檢測試劑盒（ING）分別對103份臨床血清樣品進行檢測。檢測結果均為陰性（表4），與商品化試劑盒檢測結果相比，兩者的符合率為100%。

3討論

目前，非洲豬瘟仍然是危害中國養豬業的重要傳染病，造成了極大的經濟損失。當前該病防控最主要的困擾是仍未有有效的疫苗，主要依靠檢測、監測和撲殺來綜合防控。當前病原學檢測大多依靠普通PCR和熒光定量PCR方法，但當前中國非洲豬瘟出現了新的流行特點，主要表現為由急性發病轉變為緩慢發病、出現隱性感染或耐過豬[19]和不定期排毒，這給病原的核酸檢測帶來了很大的不確定性。而豬可在感染后7～9 d產生抗體，血清學抗體檢測成為可靠的檢測、監測手段。研究結果表明，ASFV pp62蛋白具有強抗原性，在感染豬體內相應的抗體滴度較高，可作為抗原建立相應的血清學檢測方法，用于ASFV的抗體檢測[20]。在病毒顆粒成熟的過程中，pp62被S273R蛋白酶水解切割為p15、p35，p15和p35蛋白存在于成熟病毒顆粒的內膜，因此針對水解產物p15和p35蛋白開展抗體檢測、監測更能夠反映病毒感染的實際水平。本研究為了評估p35蛋白作為ELISA血清學診斷抗原的可行性，選用p35 作為包被抗原來建立ELISA檢測方法。

當前研發的各種亞單位疫苗在中國大部分豬場被廣泛應用，亞單位疫苗在研制過程中都會將抗原基因與純化標簽融合表達，這樣豬群經過多次免疫后，會產生相應的抗多聚組氨酸抗體。同時在ELISA抗體檢測方法建立的過程中，往往為了純化目的蛋白的方便，用于檢測包被的抗原大多數是與組氨酸的標簽融合表達[21-23]。用這樣的檢測方法去開展臨床豬群血清樣品的檢測，往往會出現假陽性的檢測結果。為了消除影響，本研究選用p35與ELP融合表達，并在ELP和p35蛋白之間插入了TEVP切割位點，利用ELP相變特性純化融合蛋白后，通過TEVP切割可獲得無標簽的ASFV抗原。與于學祥等[24]制備的無標簽ASFV p30蛋白相比，本研究不需要經過包涵體的變復性和鎳柱親和層析純化等復雜步驟，利用ELP標簽具有溫度敏感的可逆相變特性，通過升溫、降溫、離心和洗滌等步驟即可獲得抗原蛋白，純化過程不僅簡單，而且經濟實惠，最后得到了純度較高的無標簽p35蛋白，為使用該蛋白質作為包被抗原建立ELISA檢測方法奠定了良好的基礎。

本研究參考ASFV SY18毒株（GenBank：MH713612.1）的p35基因，該毒株是中國的流行毒株，在此基礎上建立的ELISA抗體檢測方法更具有針對性。建立的間接ELISA抗體檢測方法對FMDV、PCV2、PRRSV、CSFV和PRV均無交叉反應，可檢測稀釋400倍的陽性血清，組間重復試驗和組內重復試驗變異系數均小于5.000%，該檢測方法具有特異性好、敏感性高和重復性好的特點，且與非洲豬瘟商品化抗體檢測進口試劑盒（ING）檢測結果的符合率高達100%。

本研究成功制備了無標簽p35重組蛋白，并以此建立了ASFV抗體ELISA檢測方法，為非洲豬瘟的檢測、監測提供了更精準的技術工具。

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（責任編輯：陳海霞）