不同劑量EGCG 改善代謝綜合征的效果及其機制

馬慧，王津，額日赫木，魏嘉宇，王碩*

（1. 山西師范大學 食品科學學院，山西 太原 030031；2. 南開大學醫學院 天津市食品科學與健康重點實驗室，天津 300350）

代謝綜合征表現為肥胖、高血壓、血脂異常、胰島素抵抗和高血糖中至少3 個以上特征，其發生會增加個體罹患2 型糖尿病和心血管疾病的風險[1-2]。由于代謝綜合征病理的復雜性，很難設計一種有效預防或延緩代謝綜合征的特效藥，通常采用靶向一種病癥的單一藥物或靶向多種病癥的藥物組合進行治療，這些藥物包括他汀類藥物和降血糖藥物等[3]。近年來，食用和藥用植物及其生物活性成分由于無毒或低毒的特點，在慢性病的預防和控制中受到越來越多的關注，大量研究表明，許多食用和藥用植物或其活性成分如多酚、多糖等可以抵抗肥胖或代謝綜合征[4]。

綠茶作為一種健康飲品歷史悠久，深受世界各地人們的喜愛，對人體健康有益，可以改善代謝綜合征、降低某些慢性疾病的風險，如糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等[5-6]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG） 是綠茶多酚中含量最豐富的兒茶素，也是最具生物活性的成分，占綠茶總兒茶素的50%以上[7]。在過去的幾十年中，EGCG 對健康的有益作用已被廣泛報道，大量的細胞實驗、動物實驗和人群干預實驗都顯示出EGCG 可以減輕體重、緩解代謝綜合征、預防糖尿病及心血管疾病等[8-10]，例如，在高脂飲食條件（脂肪供能占比為60%）下，與未經EGCG 處理的小鼠相比，經過16 周EGCG 干預（在飲食中含量為0.32%）小鼠的體質量、體脂和內臟脂肪的質量顯著降低[11]，這些結果也在另外一項采用高脂/西式飲食喂養小鼠的研究中重現[12]。Sheng 等[13]指出EGCG 可能會激活肝臟法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR），而使腸道FXR 失活，這可能會對肥胖產生有益影響。此外，EGCG 對膽汁酸受體（takeda G protein-coupled receptor，TGR5） 的激活可以增加血清中酪酪肽（peotideYY，PYY） 和胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的水平，這可能有助于提高胰島素敏感性。在基因缺陷糖尿病模型db/db小鼠中，通過飲食補充EGCG（在飲食中含量為1%）可預防葡萄糖不耐受，并減少病變胰島細胞的數量[14]。

然而，不同劑量EGCG 對代謝的影響及其作用機制尚不清楚。Yang 等[15]指出EGCG 的代謝調節作用涉及2 個主要機制，包括直接機制和間接機制。直接機制直接作用于消化器官，如阻止吸收、抑制消化酶和改變微生物群，而間接機制則通過調節基因表達、蛋白質表達和包括肝臟、肌肉和脂肪組織在內的各種組織的信號轉導來介導[16]。但很少有研究關注其劑量效應，Bitzer 等[17]在用不同劑量EGCG 干預高脂飲食小鼠肥胖時發現高劑量EGCG 雖然也可以達到減肥效果，但是通過測量腸氧化應激指標，發現隨著劑量的增加，腸道氧化應激水平并沒有下降趨勢，并隨著EGCG濃度增加，氧化應激水平反而升高，表明高濃度EGCG可能具有一定的副作用。因此迫切需要引起對其劑量效應的關注。

本文根據EGCG 在茶多酚中所占比例，以C57BL/6J 小鼠為研究對象，構建高脂小鼠模型，探究不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質量和血清生理生化指標的影響，從腸道脂質吸收方面對EGCG 降脂機制進行研究，并測定不同劑量EGCG 對腸氧化應激水平的影響，旨在為指導EGCG 在代謝綜合征中的應用并降低其可能的副作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠：北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號北京SYXK（京）2017-0033。

1.2 材料與試劑

低脂對照飼料（D12450J，脂肪提供10%能量）、高脂飼料（D12492，脂肪提供60%能量）：江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；EGCG：上海源葉生物科技有限公司；谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）測定試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC） 測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG） 測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C） 測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；LunaScriptTMSuperMix Kit 反轉錄試劑盒、Luna Universal qPCR Master Mix 實時熒光定量PCR 預混液：美國NEB 有限公司；超純水：杭州娃哈哈集團有限公司；NucleoZOL 試劑：德國MACHEREY-NAGEL 公司；乙醚：天津市化學試劑六廠。

1.3 儀器與設備

超微量分光光度計（Nanophotometer N50）：德國Implen 公司；實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（real-time quantitativepolymerase chain reaction，qPCR）儀（CFX）：美國BIO-RAD 公司；酶標儀（M200pro）：瑞士Tecan 公司；組織破碎儀（TP-24）：杰靈儀器制造（天津）有限公司；數顯磁力攪拌水浴鍋（HH-6SC）：常州普天儀器制造有限公司；離心機（Sorvall ST 16R）：美國Thermo Scientific 公司；高壓滅菌鍋（CL-40M）：日本ALP 株式會社；分析天平（QUINIX224-1CN）：賽多利期科學儀器（北京）有限公司；羅氏血糖測試儀（Accu-Chek）：羅氏診斷產品（上海）有限公司；基因擴增儀（Mastercyclernexus gradient）：德國Eppendorf 公司。

1.4 方法

1.4.1 動物實驗

將60 只6 周齡C57BL/6J 小鼠置于室溫為20～25 ℃、12h 光照/12h 黑暗循環的環境中適應性喂養1 周，稱小鼠體質量并隨機分為5 組（每組12 只）：正常飲食對照組（記為NC），高脂飲食模型組（記為HFD）、低劑量EGCG 干預組（記為EL）、中劑量EGCG 干預組（記為EM）及高劑量EGCG 干預組（記為EH）。低、中、高劑量EGCG 灌胃劑量分別為50、100、200 mg/kg bw，連續灌胃12 周，并每周監測體質量，所有小鼠均可以自由采食和飲水，飼養于南開大學實驗動物中心的SPF級動物房，末次灌胃禁食12 h 后，所有實驗動物在實驗前用戊巴比妥鈉（40 mg/kg，1%水溶液，現用現配）進行麻醉以減輕疼痛并采集血液，迅速收集肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪、回腸組織，稱量肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪的質量，所有組織立即在液氮中冷凍，以便后期進行分析。所有的動物實驗操作都嚴格遵守天津市《實驗動物管理條例》的相關規定。

1.4.2 血清生化指標檢測

ALT、AST、HDL-C、LDL-C、TG、TC 均按照相應試劑盒說明書進行測定。

1.4.3 葡萄糖耐量測試（oralglucosetolerancetest，OGTT）

在第11 周，將動物過夜禁食10 h，然后灌胃葡萄糖溶液（2.0 g/kg bw）。使用血糖儀從尾靜脈尖端收集血液以進行葡萄糖灌胃之前（0 min） 和之后（15、30、60、90、120 min）血糖濃度的測量。

1.4.4 實時熒光定量PCR 檢測

使用TRIzol 試劑從冷凍的回腸組織中提取總RNA，然后用LunaScriptTMSuperMix Kit 反轉錄試劑盒合成cDNA，最后在CFX Connect 實時系統上進行qPCR 反應。qPCR 引物由天津擎科生物技術有限公司合成，引物序列見表1，其中β-Actin 基因被用作歸一化，通過2-ΔΔCt 法計算每個基因的相對表達水平。

表1 實時熒光定量PCR 所用的引物序列Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.4.5 腸氧化應激指標測定

SOD、GSH 和MDA 均按照相應試劑盒說明書要求進行測定。

1.5 數據處理

所有測試至少重復3 次，使用T 檢驗對兩組數據之間的統計學差異進行計算，P＜0.05 為有統計學差異，P＜0.01 為有顯著統計學差異，P＜0.001 為有極其顯著的統計學差異，數據表示為平均值±標準差。所有統計分析均使用SPSS 22.0 軟件進行。兩組之間的差異通過雙尾學生t 檢驗進行分析。3 組或更多組之間的差異使用單因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls 進行事后檢驗分析。當比較不同組變化涉及時間變量時，采用雙向重復測量方差分析，并用Student-Newman-Keuls 進行事后檢驗，當P＜0.05 時，結果被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 EGCG 對高脂飲食小鼠體質量和脂肪質量的影響

在為期12 周的干預過程中，不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質量和脂肪質量的影響見圖1。

圖1 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質量和脂肪指數的影響Fig.1 Effects of different doses of EGCG on the body weight and fat indexes of mice fed with a high-fat diet

由圖1A 可知，在實驗結束時，與NC 組相比，HFD組小鼠的體質量明顯增加。EGCG 干預可顯著降低高脂飲食引起的體質量增加，且隨著劑量的增加，降脂效果逐漸增強，但各劑量組間并無顯著性差異（P＞0.05）。由圖1B、圖1C 可知，相比于NC 組小鼠，HFD 組小鼠的附睪脂肪指數和腎周脂肪指數顯著增加（P＜0.05），不同劑量EGCG 均可顯著降低HFD 組小鼠的附睪脂肪指數和腎周脂肪指數（P＜0.05）。

2.2 EGCG 對高脂飲食小鼠糖代謝的影響

圖2 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠血糖的影響。

圖2 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠血糖的影響Fig.2 Effects of different doses of EGCG on the hyperglycemia of mice fed with a high-fat diet

高脂飲食造成小鼠糖耐量異常，由圖2A 可知，與HFD 組小鼠相比，低、中、高劑量EGCG 均可明顯降低60 min 時小鼠的血糖水平，從而使其接近NC 組小鼠血糖水平，其中低、中劑量EGCG 效果更佳，通過計算曲線下面積（area under the curve，AUC），結果同樣顯示EL組和EM 組小鼠葡萄糖耐受水平顯著改善（P＜0.05），而EH 組小鼠與HFD 小鼠之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 EGCG 對高脂飲食小鼠脂代謝的影響

圖3 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠脂質代謝的影響。

圖3 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠脂質代謝的影響Fig.3 Effects of different doses of EGCG on the serum lipid levels of mice fed with a high-fat diet

由圖3 可知，高脂飲食導致小鼠血脂代謝異常，特征表現為HFD 組的TC、TG 和LDL-C 的含量顯著高于其他組別（P＜0.05），所有組的HDL-C 含量均未觀察到顯著差異（P＞0.05）。不同劑量EGCG 均可顯著降低高脂飲食引起的血清TG、TC 和LDL-C 含量的升高（P＜0.05），且各劑量之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響

圖4 為EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響。

圖4 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響Fig.4 Effects of different doses of EGCG on the liver function

由圖4A 可知，各組之間肝臟指數（肝臟質量/體質量）均無顯著差異（P＞0.05）。由圖4B 可知，高脂飲食造成小鼠肝臟質量顯著高于其他組別（P＜0.05）。不同劑量EGCG 可顯著降低肝臟質量，且呈現一定的劑量依賴性。由圖4C、圖4D 可知，HFD 組小鼠的ALT 活力顯著高于NC 組（P＜0.05），表明肝功能受到了一定損傷，不同劑量EGCG 干預可顯著降低血清ALT 活力（P＜0.05），各組間AST 活力無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 EGCG 對腸道脂質吸收相關基因表達的影響

圖5 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠腸道脂質吸收相關基因表達的影響。

圖5 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠腸道脂質吸收相關基因表達的影響Fig.5 Effects of different doses of EGCG on the expression of genes related to lipid absorption in the ileum of mice fed with a high-fat diet

脂肪酸轉運蛋白CD36 和脂肪酸轉運蛋白4（FATP4） 以及乳糜微粒的載脂蛋白ApoB48 是3 個影響脂質吸收的重要蛋白。由圖5 可知，在基因水平上，與NC 組小鼠相比，高脂飲食引起CD36 和ApoB48 表達的上調，不同劑量EGCG 均可顯著下調CD36 及ApoB48 的表達水平（P＜0.05），中、高劑量EGCG 對CD36的影響程度高于低劑量EGCG，各組之間FATP4 表達水平無顯著差異（P＞0.05）。

在腸道中高表達的CD36 蛋白在脂肪酸的攝取過程中發揮著重要作用[18]，FATP4 也參與腸道脂肪酸的攝取[19]，在餐后條件下，80%～90%的脂質運輸并裝載于含ApoB48 蛋白的乳糜微粒中，乳糜微粒負責將外源性食物中的脂肪從小腸攜帶到肝臟[20-21]，在本研究中發現EGCG 可以降低小腸中CD36 和ApoB48 的基因表達水平，證明EGCG 可以減少腸道對脂質的吸收。綜上，不同劑量的EGCG 可能通過下調腸道中脂質吸收相關基因的表達，減少機體對脂質的吸收，從而達到改善脂質代謝、調節代謝綜合征的效果。

2.6 EGCG 對腸氧化應激指標的影響

不同劑量EGCG 對腸氧化應激指標的影響如表2所示。

表2 不同劑量EGCG 對腸氧化應激指標的影響Table 2 Effects of different doses of EGCG on oxidative stress indicators in the ileum

由表2 可知，與NC 組小鼠相比，高脂飲食引起腸氧化應激水平升高，包括引起SOD 含量和GSH 含量下降，以及MDA 含量的上升。隨著EGCG 劑量的增加，腸道氧化應激水平并沒有下降趨勢，并隨著EGCG濃度增加，中、高劑量EGCG 會升高氧化應激水平，減少GSH 含量，表明高劑量EGCG 可能具有一定的副作用，這與Bitzer 等[17]的研究結論相一致。

3 結論

本研究通過檢測糖脂代謝表觀指標以及與腸組織中脂質代謝相關蛋白基因的表達水平，探究不同劑量EGCG（50、100、200 mg/kg bw）對高脂飲食小鼠脂代謝的效果及機制研究。結果表明，與高脂對照組比較，不同劑量EGCG 均可顯著降低小鼠體質量，改善脂質代謝異常，減輕肝臟損傷，且各劑量之間并無顯著差異，只有低、中劑量EGCG 可改善糖代謝，進一步研究發現各劑量EGCG 可能通過減少腸道對脂質的吸收從而達到改善代謝綜合征的效果，但中、高劑量EGCG可能具有一定的腸毒性。