圍絕經期婦女PD-1的表達及意義

吳 靜王 琳凌 晨祁松楠趙瑞珂顧國浩▲

1.江蘇省鹽城市婦幼保健院檢驗科，江蘇鹽城 224002；2.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科，江蘇蘇州 215006

圍絕經期婦女PD-1的表達及意義

吳 靜1王 琳2凌 晨2祁松楠2趙瑞珂2顧國浩2▲

1.江蘇省鹽城市婦幼保健院檢驗科，江蘇鹽城 224002；2.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科，江蘇蘇州 215006

目的 探討圍絕經期婦女外周血單個核細胞共刺激分子PD-1mRNA和T細胞表面PD-1分子的表達和意義。 方法 采用Taqman探針實時熒光定量PCR法、流式細胞術檢測70例圍絕經期、40例絕經后期和30例育齡期組外周血單個核細胞PD-1mRNA的表達。 結果 PD-1mRNA的表達在三組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），與育齡期組相比，圍絕經期組及絕經后期組PD-1mRNA表達量均顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；T細胞表面PD-1的表達在三組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），圍絕經期及絕經后期組CD4+T細胞和CD8+T細胞的PD-1水平低于育齡期組（P＜0.05）。 結論 共刺激分子PD-1的異常表達可能與圍絕經期婦女免疫功能失調有關。

圍絕經期；實時熒光定量PCR；流式細胞術；免疫功能；PD-1

在大多數婦女老齡化的進程中，圍絕經期是一個必經的重要時期。圍絕經期是指從接近絕經出現與絕經有關的內分泌、生物學和臨床特征起至最后1次月經后1年內的時期。處于圍絕經期的婦女由于卵巢功能衰退，神經、內分泌及免疫系統均會出現紊亂而引起一系列相應的臨床癥狀，如出現潮熱、出汗、情緒不穩定、心悸、胸悶、失眠等癥狀。目前的臨床研究多集中于圍絕經期婦女相關激素水平的研究，對該期婦女的免疫功能方面的研究相對較少。共刺激信號對于機體維持免疫功能穩態具有重要作用，程序性死亡受體1（programmeddeath1，PD-1）是一種重要的共刺激分子，為CD28超家族成員，與其相應的配體結合后發揮負性免疫調節作用。本課題選取了與免疫功能相關的重要分子PD-1，運用實時熒光定量PCR技術檢測其mRNA表達，流式細胞術檢測其在T細胞表面的表達。從轉錄和翻譯水平探討圍絕經期及絕經后期婦女免疫功能的變化。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2013年6月～2014年1月于蘇州大學附屬第一醫院及鹽城市婦幼保健院高級體檢中心體檢的140例健康婦女血清，年齡19～73歲。其中，圍絕經期組70例，平均年齡（42.5±3.6）歲，入選標準為出現月經不規律現象到停經1年內的婦女；絕經后期組40例，平均年齡（53±7.3）歲，入選標準為停經1年以上的婦女；育齡期組30例，平均年齡（34.4±6.8）歲，入選標準為月經周期正常的育齡期女性。排除標準：（1）有肝、腎等內科疾病者；（2）有免疫系統或內分泌系統疾病者；（3）有婦科器質性病變或曾行卵巢切除術者；（4）服用激素類藥物及半年內有外科手術史者；（5）2周內曾患急性感染性疾病者。

表1　PCR引物序列及產物片段大小

1.2主要儀器及試劑

Trizol試劑（Ambion公司），Ficoll淋巴細胞分離液（上海恒信試劑公司），RNA逆轉錄試劑盒（天根公司），RealMaster Mix試劑盒（天根公司），eppendorf—centrifuge 5430R低溫高速離心機（德國eppendof公司），GeneAmp PCR System9700擴增儀（美國ABI公司）、LightCycler 480Ⅱ擴增儀（Roche公司），Thermo Spectronic紫外分光光度計（美國Spectronic），鼠抗人CD3-FITC熒光素標記單克隆抗體，鼠抗人CD8-Pe-CY7熒光素標記單克隆抗體，鼠抗人PD-1-PE熒光素標記單克隆抗體，溶血劑（溶血素∶蒸餾水=1∶9），IgG-PE同型對照，溶血劑（溶血素∶蒸餾水=1∶9）（單克隆抗體均購自美國BD公司），流式細胞儀FACSC Calibur型（美國BD公司）。

1.3方法

1.3.1標本收集 月經周期規則者于周期3天抽血，已絕經者可隨時抽血，所有研究對象均于清晨空腹時抽取靜脈血5mL，乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）抗凝備用。

1.3.2外周血單個核細胞分離 取Ficoll淋巴細胞分離液3mL于試管中，吸取稀釋好的外周血沿管壁緩緩加入淋巴細胞分離液中，水平離心機2000rpm離心20min，吸取中間層云霧狀單個核細胞1.5mL于離心管中，10000rpm離心1.5min，棄上清，加入1mL生理鹽水混勻，10000rpm離心1.5min，棄上清，加RNAisoRegent混勻，于-80℃低溫冰箱保存備用。

1.3.3總RNA提取 加入200μL氯仿，猛烈顛倒混勻20次，冰浴5min，低溫離心機4℃，12000rpm離心6min，取上清至1.5mLEP管中，加入異丙醇500μL顛倒混勻，冰浴5min，低溫離心機4℃，12000rpm離心6min，棄上清，加入1000μL75%乙醇（0.1%DEPC水配制）混勻，低溫離心機4℃，12000rpm離心5min。棄去上清后倒置室溫干燥15min，加20μL 0.1%DEPC水溶解。1∶50稀釋提取的總RNA，使用紫外分光光度計檢測在260nm、280nm處光密度值（OD值），比值在1.8～2.0之間，說明完整性良好。

1.3.4逆轉錄 反應體系（40μL）：Rnase Free ddH2O 19μL，Reverse Transcriptase M-MLV（200u/μL）1μL，5×Reverse Tanscriptase M-MLV Buffer8ul，dNTP Mixture（10mM）2μL，Random 9 mers（200u/μL）4μL，RNAsafe（20×）2μL，Total RNA 4μL。將上述 反應體系 混勻，于GeneAmp PCR System9700擴增儀上42℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 1min進行反應，合成的cDNA保存于-80℃冰箱備用。

1.3.5標準品制備 采用本室制備的β-actin質粒標準品，濃度分別為3.34×108、3.34×107、3.34×106、3.34×105、3.34×104copies/mL。

1.3.6引物與探針設計及合成 引物與探針均由上海閃晶生物技術研究所設計并合成，見表1。

1.3.7實時熒光定量PCR反應 將逆轉錄形成的cDNA、陰性對照、質粒標準品使用LightCycler 480 Ⅱ擴增儀進行擴增，反應體系（25μL）：ddH2O 10μL，2.5×realMasterMix 10μL，正向引物（5pmol/μL）1μL，反向引物（5pmol/μL）1μL，探針（5pmol/μL）1μL，20×Probe Ehancer solution 1μL，模版1μL。設置循環反應參數：94℃預變性1min；94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 1min，共計40個循環。根據空白對照調整擴增基線，根據標準的擴增曲線計算每個標本的基因表達量。采用相對定量法，用內參基因β-actin將目的基因PD-1校正至108copies/mL，取校正后目的基因拷貝數的對數為最終有效數據來進行統計分析。

1.3.8流式細胞術檢測T細胞表面分子的表達 將EDTA-Na2抗凝外周血混勻備用，每個樣本準備2個流式管，每管加入50μL的全血，2個流式管中依次加入20μL CD3/CD8/PD-1和CD3/CD8/IgG-PE同型對照管，振蕩混勻，室溫避光孵育15min，加入1mL溶血劑，振蕩混勻，室溫避光孵育12min，加入1mL的PBS，振蕩混勻，1500rpm/min離心5min，棄上清，加入300μL PBS，重懸細胞，上機分別測定CD4+、CD8+和CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1的表達。

1.3.9外周血淋巴細胞絕對值的檢測 使用全自動血細胞分析儀檢測淋巴細胞絕對值（×109/L），淋巴細胞計數值與流式細胞獲得的PD-1表達率相乘得到PD-1分子的表達量（×106/L）。

1.4統計學分析

使用SPSS17.0統計軟件進行分析，數據正態分布檢驗使用Kolmogorov-Smirnov檢驗法，正態分布資料以表示，非正態分布資料以中位數（四分位數）表示；組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis H檢驗，兩樣本均數的比較采用t檢驗和Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表2　研究對象外周血T表面共刺激分子PD-1表達量[或M（P25～P75）]

表2　研究對象外周血T表面共刺激分子PD-1表達量[或M（P25～P75）]

注：與育齡期組比較，aP＜0.05

圍絕經期組　　絕經后期組　　育齡期組　　統計量　P CD4+PD-1+（%）　8.96±4.9a　8.95±1.76a　12.69±2.21　10.99　?。?.05 CD4+PD-1+（×106/L）　140.98（97.89～209.65）a168.23（120.21～196.89）a　248.56（211.32～295.65）　38.65　　＜0.05 CD8+PD-1+（%）　6.24±3.28a　5.44±1.50a　7.17±2.02　19.99　?。?.05 CD8+PD-1+（×106/L）　121.23±50.32a　104.01±35.21a　150.23±65.23　9.65　?。?.05

2　結果

2.1圍絕經期和絕經后期婦女外周血單個核細胞表面共刺激分子PD-1 mRNA表達

PD-1mRNA的表達在三組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），圍絕經期組PD-1 mRNA的表達量為（5.07±0.88），絕經后期組PD-1 mRNA的表達量為（5.46±0.68），育齡期組PD-1 mRNA的表達量（4.43±0.89），與育齡期組相比，圍絕經期組及絕經后期組PD-1mRNA表達量顯著增高（P＜0.05）。見圖1。

2.2圍絕經期和絕經后期婦女外周血T細胞表面共刺激分子PD-1的表達量分析

外周血T細胞表面PD-1分子相對表達率（%）和絕對值（×106/L）在三組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），CD4+T細胞PD-1相對表達率（%）和絕對值（×106/L）在圍絕經期和絕經后期均低于育齡期組（P＜0.05），CD8+T細胞的PD-1的相對表達率（%）和絕對值（×106/L）在圍絕經期和絕經后期均低于育齡期組（P＜0.05）。見表2，圖2。

圖1　圍絕經期、絕經后期和育齡期組PD-1 mRNA表達比較

圖2　圍絕經期、絕經后期和育齡期組T細胞表面PD-1表達量比較

3　討論

圍絕經期（perimenopausal period）是指婦女從臨床上或血中激素水平開始出現卵巢功能衰退的征兆至最后1次月經后1年的時期[1]。圍絕經期的平均年齡段在45～55歲之間，約持續5年左右，近年來有提前的趨勢，圍絕經期以卵巢功能衰退，雌激素水平降低為主要特征，可伴隨出現一系列退行性改變如月經紊亂、骨質疏松癥、心血管疾病、生殖道腫瘤等。雌激素受體可分布于女性多個部位組織和器官的細胞膜上，雌激素水平低下使這些組織和器官發生退行性變，引起心腦血管系統、泌尿生殖系統等的功能紊亂。胸腺是人體重要的中樞免疫器官，胸腺的萎縮直接影響機體的細胞免疫功能，同時對體液免疫也有一定影響[2]。PD-1是一種重要的免疫抑制分子，為CD28超家族成員，PD-1與其相應的配體結合可參與如病毒感染，自身免疫性疾病，腫瘤等多種病理進程[3-5]。以PD-1為靶點的免疫調節對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等有重要的意義。近年來，通過阻斷PD-1信號通路來治療各種腫瘤的研究也取得了很大的進展[6-11]，顯示了PD-1在機體免疫功能研究中不容忽視的地位。

PD-1分子其與配體PD-L1結合能產生負向刺激信號，導致T淋巴細胞功能受到抑制，增殖、活化及分泌細胞因子能力降低[11]。在許多慢性病毒感染中，PD-1/PD-L1發揮著很重要的作用，有研究發現患者在抗病毒治療前CD8+T淋巴細胞表面PD-1顯著高于治療后和健康對照組[12]，表明PD-1分子與機體免疫功能狀態密切相關。本研究以PD-1分子為出發點，著重研究外周血單個核細胞PD-1mRNA的表達及T細胞表面PD-1分子的表達，從不同層面探討其變化與婦女圍絕經期的關系。本次研究中發現：圍絕經期和絕經后期婦女PD-1mRNA表達顯著升高，因此我們推測絕經后婦女T淋巴細胞功能受到抑制，并可能導致免疫功能紊亂。但是我們發現：圍絕經期和絕經后期婦女T細胞表面PD-1表達量顯著低于育齡期組，這與mRNA的表達結果不一致，推測該分子在轉錄和翻譯水平的表達不同，這為進一步研究PD-1的表達機制提供了一定的線索。有學者發現：多發性硬化癥小鼠模型經雌激素治療后T細胞表面PD-1的表達存在劑量效應關系， 提示雌激素可能通過上調T細胞PD-1的表達發揮免疫抑制功能[13]。有研究顯示[14]，胸腺細胞及外周血單個核細胞上均存在性激素受體，性激素通過與受體結合發揮作用。由于絕經期婦女雌激素水平降低，與T細胞表面的雌激素受體結合能力也隨之減弱，導致CD4+PD-1+、CD8+PD-1+的表達量下降。由此我們推測，圍絕經婦女雌激素水平下降對PD-1可產生一定的影響。

綜上所述，圍絕經期及絕經后期女性存在內分泌激素和細胞免疫功能的紊亂、外周血共刺激分子PD-1表達異常與其免疫功能紊亂可能存在一定的聯系。同時，共刺激分子的表達在轉錄階段與翻譯階段存在一定的差異，其調控網絡復雜，有待進一步研究探索。

[1] Strauss J F，Barbieri R C，林守清.生殖內分泌學[M].第5版.北京：人民衛生出版社，2006：417-420.

[2] 梁文郁.中西醫結合防治更年期綜合征[J].中國中醫基礎醫學雜志，1999，5（3）：57-59.

[3] Trautmann L，Janbazian L，Chomont N，et al.Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+T cells leads to reversible immune dysfunction[J].Nature medicine，2006，12（10）：1198-1202.

[4] Ansari M J I，Salama A D，Chitnis T，et al.The programmed death-1（PD-1）pathway regulates autoimmune diabetes in nonobese diabetic（NOD）mice[J].The Journal of Experimental Medicine，2003，198（1）：63-69.

[5] Thompson R H，Dong H，Lohse C M，et al.PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells and is associated with poor outcome for patients with renal cell carcinoma[J].Clinical Cancer Research，2007，13（6）：1757-1761.

[6] Topalian S L，Drake C G，Pardoll D M.Targeting the PD-1/B7-H1（PD-L1）pathway to activate anti-tumor immunity[J].Current Opinion in Immunology，2012，24（2）：207-212.

[7] Sznol M，Chen L.Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1（PD-L1）in the treatment of advanced human cancer[J]. Clinical Cancer Research，2013，19（5）：1021-1034.

[8] Duraiswamy J，Freeman G J，Coukos G.Therapeutic PD-1 pathway blockade augments with other modalities of immunotherapy T-cell function to prevent immune decline in ovarian cancer[J].Cancer Research，2013，73（23）：6900-6912.

[9] Hamid O，Robert C，Daud A，et al.Safety and tumor responses with lambrolizumab（anti–PD-1）in melanoma[J].New England Journal of Medicine，2013，369（2）：134-144.

[10] Brahmer J R，Horn L，Gandhi L，et al.Nivolumab（anti-PD-1，BMS-936558，ONO-4538）in patients（pts）with advanced non-small-cell lung cancer（NSCLC）：Survival and clinical activity by subgroup analysis[C].ASCO Annual Meeting Proceedings，2014，32（15suppl）：8112.

[11] Freeman GJ，Long AJ，Iwai Y，et al.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J].Exp Med，2000，192（7）：1027-1034.

[12] 王琳，趙春楠，祁松楠，等.慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞表面共刺激分子表達量變化及意義[J].中華檢驗醫學雜志，2014，37（2）：105-109.

[13] Dinesh RK，Hahn BH，Singh RP.PD-1，gender，and autoimmunity[J].Autoimmunity Reviews，2010，9（8）：583-587.

[14] 譚家余，吳迎星，吳賽珠，等.老年男性性激素水平與外周血T淋巴細胞亞群的相關性研究[J].中華老年醫學雜志，2002，6：38-39.

The expression and significance of PD-1 inperimenopausal and postmenopausal women

WU Jing1WANG Lin2LING Chen2QI Songnan2ZHAO Ruike2GU Guohao2
1.Department of Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital,Yancheng 224002,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To investigate the expression of PD-1 mRNA in peripheral blood mononuclear cells and the expression of PD-1 on T cells in perimenopausal and postmenopausal women. Methods The mRNA expression of PD-1 mRNA were detected by Taqman probe real-time quantitative PCR,and the levels of PD-1 on T cells were determined by Flow Cytometry.The subjects in the study included 70 perimenopausal women,40 postmenopausal women and 30 childbearing age women. Results The expression ofPD-1 mRNA differed significantly in these three group(P＜ 0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 mRNA level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly increased(P＜0.05);The expression ofPD-1 on T cells differed significantly in these three group(P＜0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly decreased(P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of PD-1 may be closely related to the immune dysfunction of perimenopausal women.

Perimenopausal women;Real-time quantitative PCR;Flow Cytometry;Immune function;PD-1

R711.51

A

2095-0616（2015）09-13-05

▲

（2015-02-05）