膠體金免疫層析技術在農藥殘留檢測中的應用

梁才英

（欽州市欽北區那蒙鎮農業農村服務中心，廣西欽州 535000）

農藥能夠有針對性地預防、控制并消除病蟲草，主要應用于農業、林業、牧業以及漁業等產業中，保障植物、動物的生長與繁殖，對于提高產量有著非常重要的作用。我國關于農藥的使用有著十分完善的管理制度，但仍舊無法完全規避農藥濫用、泛用等問題，不僅對生態環境造成了較大的破壞，也威脅著人們的生命健康。常見的農藥殘留檢測方法主要包括大型儀器檢測和免疫檢測，雖然前者檢測結果的準確率較高，但操作復雜、檢測周期較長且花費較高，不適用于流通時間較短的果蔬。膠體金免疫層析技術屬于后者，1971 年首次出現，主要是利用膠體金作為示蹤標志物，以纖維層析材料為固相反應界面，利用抗原抗體的特異性結合原理，在毛細作用下觀察樣品溶液中膠體金產物的定向流動[1-2]， 操作便捷且檢測快速，除了應用于農藥殘留檢測之外，還廣泛應用于疾病診斷、食品檢測、重金屬等環境污染物的檢測中，檢測效果理想。

1 膠體金免疫層析技術的應用原理及特點

1.1 原理

膠體金也被稱為氯金酸水溶液，與白磷和檸檬酸三鈉結合能夠在還原反應、聚合反應作用下形成一種大小基本相等的顆粒物質，此類顆粒物質在受到靜電作用時還會反應形成一種膠體溶液[3]。其電子密度極高、穩定性極強，如果顆粒物質的聚集密度超過規定閾值，其表面還會形成面積較大的紅色斑點，便于肉眼或儀器觀察，檢驗人員只需要觀察被檢測物質中的紅色斑點數量便可以得出結果，因此，如果將膠體金作為免疫層析檢測中的指示物，則能夠以膜為載體，完成對特殊抗原或抗體的固定，繼而實現毛細作用下被測物質在層析試條上的持續運動[4]。此外，需要注意的是，不同還原劑所產生的顆粒是不同的，在檢測過程中會呈現出不同的特點，而膠體金能夠滿足不同物質的檢測需要，并能最大限度確保檢測結果準確。

1.2 特點

膠體金免疫層析技術操作簡單且具有較高的靈敏度，主要呈現出以下特點：①該檢測技術的檢測范圍較廣，除了能夠檢測出食品等被測物質中的農藥殘留，還能檢測出微生物、真菌霉素等，甚至可以同步檢測出被測物質是否含有違禁藥品；②該檢測技術的檢測方法十分便捷，只需要簡單處理樣品后肉眼觀察即可，不需要借助設備或儀器便能保證檢測結果的準確性，因此不要求檢測人員具有高超的知識與專業技能；③相比于傳統的酶標記、放射性同位素以及熒光素等檢測技術，該檢測技術所使用的試劑安全性更高，既能夠保證檢測環境無污染，還能避免對檢測人員的身體造成傷害；④當前市面上流通的膠體金免疫層析檢測卡靈敏度為1 ng·mL-1，相比于其他檢測方法具有更高的靈敏度，這是因為該檢測技術只需要標記單克隆抗體，同時對其有特異性、親和性的只有抗原決定簇[5]；⑤該檢測技術所使用的試條具有較為穩定的化學性質，主要是膠體金吸附被測物質中的蛋白質進行吸附并標記，且不會影響到蛋白質活性，同時兼具質量小的特點，便于檢測人員隨身攜帶并隨時展開現場檢測工作。

2 膠體金免疫層析技術在農藥殘留檢測中的應用——以克百威為例

2.1 克百威介紹

克百威是一種高效殺蟲劑，屬于氨基甲酸酯類，應用于蔬菜、糧食、水果等農作物中能夠有效防治害蟲，應用時會將其直接噴灑在農作物根部，待根系吸收后隨著水分傳送至葉子、莖部，實現內吸殺蟲的效果。但是，克百威具有較高的毒性，一旦暴露在空氣中，很長時間都不會消散，不僅無法在酸性土壤中降解，會污染土壤和地下水，還會威脅到周邊鳥類及水生動植物的安全。如果在農作物上大量使用克百威，便會形成農藥殘留。相關研究發現，克百威會影響到γ-谷氨酰轉移酶的血清活性，嚴重的還會導致肝臟的充血性壞死。大鼠實驗結果表明克百威有著較為顯著的肝毒性作用與致突變性，如果食品中殘留有克百威，則會嚴重危及人們的生命健康[6]。

2.2 膠體金免疫層析技術檢測克百威的具體方法

2.2.1 膠體金單克隆抗體偶聯物的制作

在膠體金懸浮液中加入0.2 mol·L-1的碳酸鉀溶 液，一邊攪拌一邊加入抗體溶液直至溶液的酸堿度達到8.2、濃度達到2 μg·mL-1，將溶液溫育30 min后加入1%濃度的牛血清白蛋白溶液，持續攪拌 20 min 以確保膠體金的穩定性。將得到的溶液混合物在4 ℃環境中作離心處理，時間大約為15 min，結束后再用1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液進行溶液沉淀，通常需要洗滌3 次，沉淀后將沉淀物放入含有1%牛血清白蛋白和0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，將其保存于4 ℃的環境中備用。整個過程需要特別注意溶液酸堿度的檢測，且將備好的膠體金抗體偶聯物用在試紙條的準備中則能夠檢測出其性能。

2.2.2 膠體金試紙條的組裝

目前市面上常見的試紙條包括硝酸纖維素膜、共軛墊、吸收墊和樣品墊。當克百威樣品溶液被加入到樣品墊時，在層析作用力下會定向流動至吸收墊，此時樣品溶液中的抗原便會與共軛墊上的膠體金標記結合，而后繼續移動，與對照線上的抗原、抗體結合，此時由于膠體金標記無法與測試線包被抗原結合，測試線上的顏色越淺，樣本溶液中的抗原濃度就越高。利用點樣儀（型號為BioDot Quanti3000）在硝酸纖維素膜上加入山羊抗小鼠IgG 作為對照線，加入3-琥珀酰-克百威-OVA 作為測試線，再用點樣儀將備好的膠體金單克隆抗體偶聯物固定到共軛墊上，組裝好膠體金條與外殼則完成試條的組裝，將其保存于4 ℃的環境中。膠體金試紙條的最小濃度以測試線完全不可見為標準，當試紙條中加入克百威樣品，則測試線的顏色通常比對照線的顏色淺，如果在試紙條中加入空白溶液，則測試線與對照線的顏色相同，如果加入溶液后沒有出現對照線，則表示樣品無效[7]。

2.2.3 標準曲線的建立

膠體金試紙的檢測限就是使測試線完全不可見的最小濃度，因此將一系列梯度稀釋的標準溶液濃度加入試紙條中，即0 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、 0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1和20.00 ng·mL-1，當膠體金測試線相比對照線明顯較弱時，得到克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1。

2.3 檢測結論分析

本次研究中利用膠體金分別檢測了不同濃度的克百威試紙條，結果顯示膠體金對克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1，而根據調查，如果隱形添加的克百威濃度超過2%，稀釋1 000 倍后的克百威含量仍不低于20 mg·L-1，所以應用膠體金免疫層析技術能夠檢測出市面上絕大多數物品中的克百威濃度超標問題。另外，本次測試沒有特別使用緩沖液或純凈水，只需要用自來水將被測物質進行稀釋便可直接檢測，不需要采用特定的純凈水或緩沖液，便于現場實時快速檢測，更加適用于稀釋條件不高的環境，可以簡單快速地檢測出被測物品中是否有克百威農藥殘留。

3 膠體金免疫層析技術在農藥殘留檢測中的應用發展趨勢

膠體金免疫層析技術最早應用于醫學領域，近幾年隨著我國對食品安全問題的重視，才逐漸延伸至安全質量檢測領域，如農藥殘留檢測等。利用膠體金作為單一常規標記材料，可直觀顯示被測物質中的農藥殘留。在未來，科技的進步使得大量新型材料相繼問世，納米磁珠、鑭系稀土、熒光微球等新型材料均可作為標記材料代替膠體金[8-9]。技術的革新要求相關研究人員不斷提升專業知識與技能儲備，充分利用多種標記材料以實現檢測結果的進一步優化。總的來說，膠體金免疫層析技術在農藥殘留檢測中的應用發展趨勢主要是實現標記材料的不斷升級。只有實現標記材料的升級優化，才能不斷提升檢測靈敏度與檢測效率，提高檢測的準確性與可靠性。

當前膠體金層析免疫技術在食品農藥殘留檢測中的應用效果良好。膠體金免疫層析技術可以快速、準確地檢測出被測物質中的農藥殘留，操作簡單且準確率高，試紙條也便于攜帶，能夠在現場實時完成檢測工作，其檢測原理主要是識別抗體、抗原或半抗原之間的特異性反應，是一種以此為基礎所建立的生物化學分析方法，但是在檢測之外，檢測人員還需要對被測物質進行簡單的前期處理。在農藥殘留檢測中，部分被測物質的前期處理工作十分煩瑣，且每一次檢測都需要使用一個試紙條，導致檢測成本增加。因此，膠體金免疫層析技術的未來發展方向要著重于高通量試紙條或檢測卡的研究，以不斷減少成本。

另外，在以往傳統的膠體金免疫層析技術檢測中通常只能檢測出一種農藥殘留，且屬于定性檢測，或者對被測物質中的某種農藥殘留進行半定量檢測。如果被測物質中的農藥殘留量超過膠體金試紙條所能檢測出的最大限量，則無法準確定量地檢測出實際殘留。對此，相關研究人員不斷優化檢測試紙條與檢測方法，以期能夠不斷擴大定量精度、檢測范圍，結果發現將單一顏色的檢測線進行多條組合，然后將其置于同一層析膜上，則能夠大大提升膠體金試紙條的檢測效果，對單一農藥殘留的定性或對多種類農藥殘留的定量分析，在節省檢測時間的同時還能為檢測人員提供更多的關聯信息。需要注意的是，樣品墊與檢測線之間的距離越大，被測溶液層析后到達檢測線的時間就越長，加上無法避免多條檢測線之間相互干擾，因此檢測結果無法達到預期[10]。若要實現膠體金層析技術在多種農藥殘留中的檢測效果，僅在單層析膜上添加多條檢測線是不夠的。應用多條檢測線的膠體金免疫層析技術進行檢測，除了需要考慮到靈敏度、特異性、產品穩定性等常規量之外，還應當充分考慮到多條檢測線之間的距離，被測物質層析速度以及檢測時的浸提液使用量等，不斷優化試紙條材質，以逐步提高檢測線的顯示清晰度和均勻度，最大限度保障檢測結果的準確可靠。

4 結語

綜上所述，在進行農藥殘留檢測時，相比于需要利用大型儀器的氣相色譜、液相色譜等檢測技術，膠體金免疫層析技術操作更加簡單，所獲得的檢測結果也準確可靠，更加適用于快速篩查果蔬等物質中的農藥殘留。膠體金免疫層析技術僅僅是免疫檢測方法中的一種。已經有研究表明，多種方式聯合檢測能夠進一步提高檢測準確率，因此在未來，免疫層析的多組分檢測方法將成為一種主流應用趨勢，農藥殘留檢測技術的選擇依據則會趨向于減少檢測成本，并同步滿足被測物質中多種農藥的同時檢測需求。