淺談影響禽流感血凝和血凝抑制試驗結果的因素

倪興維 汪忠榮 張霞 徐婷婷 李照偉 毛以智 劉霞

摘? 要：禽流感血凝和血凝抑制試驗是評價禽流感疫苗免疫效果最常用的方法，具有操作簡單、結果判定快速且不需要特殊的儀器設備等優點，但該試驗在實際操作中受多種因素的影響，筆者結合臨床工作經驗，初步探討影響禽流感血凝和血凝抑制試驗結果的因素。

關鍵詞：禽流感；血凝；血凝抑制；因素

中圖分類號：S831.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）04-0031-03

高致病性禽流感是嚴重威脅全球養禽業健康發展的禽病之一，世界動物衛生組織將其列為必須通報的動物疫病，我國農業農村部將其列為一類的動物疫病。2004年開始，我國對H5亞型禽流感實施強制免疫[1]，2017年秋季開始對H7N9禽流感實施強制免疫[2]，并要求開展免疫效果評價，為制定相應的禽流感防控措施提供依據。

禽流感免疫效果評價最常用的方法是血凝和血凝抑制試驗，該方法具有操作簡單、結果判定快速且不需要特殊的儀器設備等優點，因此被基層獸醫實驗室、養殖場等廣泛使用。該試驗操作過程需參照統一的國家標準，即《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936-2020）（以下簡稱《診斷技術》）?！对\斷技術》中明確規定了禽流感血凝和血凝抑制試驗的操作步驟、結果判定、注意事項等相關內容，但該試驗在實際操作中受多種因素的影響，存在同一樣本不同檢測人員出現檢測結果不同的現象。為此，筆者結合臨床工作經驗，初步探討血凝和血凝抑制試驗結果的影響因素。

1? 被檢樣本對試驗結果的影響

被檢樣本出現溶血、腐敗、含有非特異性物質等現象，均嚴重影響試驗結果。因此，采樣后將樣本傾斜放置，自然析出血清，避免搖晃，防止溶血；若血清樣本不能及時進行檢測應冷凍保存，冷凍后的血清應避免反復凍融，以免腐敗變質。

2? 紅細胞懸液制備對試驗結果的影響

紅細胞懸液濃度、純度及配制時間均會影響試驗結果。按照《診斷技術》要求，該試驗使用1％紅細胞懸液，紅細胞應來源于3羽無特定病原體（specific pathogen free，SPF）公雞，但在實際過程中，很難找到能夠符合SPF公雞標準的公雞，為此可增加紅細胞洗滌次數，通過眼睛觀察洗滌并離心的紅細胞懸液，上清液以清澈為準；采集血液時加入抗凝劑的量應適中，過多會抑制凝集現象的產生，影響紅細胞結果，過少易產生血凝塊，影響試驗觀察；血液采集后沿管壁緩慢打入離心管中，避免用力過猛而破壞紅細胞結構；洗滌離心時轉速不易過高，一般為2 000ｒ/min，離心5～10 min，最后一次離心10 min；配制1％紅細胞懸液時，吸取壓積紅細胞應從離心管底部吸取，但不能將移液器槍頭尖貼緊底部，且吸取速度應緩慢，轉入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中時應懸空緩慢加入，且避免吹打清洗槍頭。1％紅細胞懸液應盡可能現配現用，確需延長使用時間時，應冷藏保存，且時間一般不超過3 d。

3? 四單位抗原配制對試驗結果的影響

四單位抗原配制時間和濃度均會影響試驗結果，因此使用前應按照《診斷技術》介紹的方法進行四單位驗證。使用現配四單位抗原和提前配制四單位抗原，試驗結果會出現極顯著差異，其主要原因是抗原在空氣中暴露時間長，導致活性降低，且抗原液的溶劑隨著時間延長而蒸發，使抗原液濃度增大，導致試驗結果偏大。因此在實際操作過程中，應合理安排四單位抗原配制時間，盡可能做到現配現用，降低誤差。此外，四單位抗原配制時，吸取轉移濃縮抗原應先在濃縮抗原瓶中吹打槍頭2～3次，吸取速度應緩慢，轉移到PBS緩沖液中時應懸空加入，且避免吹打清洗槍頭。

4? 移液器的使用對試驗結果的影響

整個試驗過程經常使用移液器，因此移液器是否正確使用將直接影響試驗結果。在試驗過程中，移液器要垂直使用，但在實際操作過程中尤其是大量檢測時，幾乎不能按要求正確使用，因此在使用移液器時可以有一定的傾斜，但應保證每次傾斜角度大致相同；在吸取轉移試劑或樣本時，應先在試劑或樣本中吹打2～3次以潤濕槍頭（配制1％紅細胞懸液除外）再吸??；在倍比稀釋抗原和樣本時，每孔的稀釋方式（一檔吸一檔打還是一檔吸二擋打）、稀釋次數、稀釋力度、稀釋時間、槍頭在反應孔內的深度等均盡可能相同；加入1％紅細胞懸液時槍頭在紅細胞瓶內吸取的位置盡可能一致，且紅細胞瓶應不斷搖勻，確保每孔紅細胞懸液濃度一致；在反應孔中加入1％紅細胞懸液、四單位抗原等試劑時，移液器使用力度不易過大但要干脆利落，避免試劑與孔壁或孔內液體相沖，導致加入液體反彈回孔外，且按照從低倍到高倍的順序加入，避免交叉污染。

5? 其他影響因素

試驗中使用振蕩器時，振蕩力度不易過大，否則易破壞紅細胞或抗原、抗體原有結構，導致結果出現誤差；在判定血凝和血凝抑制結果時，避免反復顛倒反應板，且嚴格遵守完全凝集和完全抑制凝集這一標準。

影響血凝和血凝抑制試驗結果的細節環節很多，涉及樣本的采集保存、試劑配制、移液器使用、結果判定等多方面。因此，在實際檢測過程中，除嚴格按照《診斷技術》中的要求進行操作外，還應注意操作中的細節，從而提高試驗結果的準確性，真正做好禽流感抗體檢測和疫苗免疫效果評價，為禽流感防控工作提供可靠的數據支撐。

參考文獻

[1] 關于印發2004年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃的通知[Z]．北京：農業部．2004.

[2] 農業部關于切實做好全國高致病性禽流感秋季免疫工作的通知[Z]．北京：農業部．2017.