豬圓環病毒2型滅活疫苗佐劑選擇

趙本進 何錫忠 林鷙 繆德年 彭麗英

摘? 要：用水包油佐劑Merckinade SDA 25、HS1010和雙向佐劑Montanide ISA 206三種不同佐劑分別制成豬圓環病毒2型滅活疫苗，對三種疫苗的穩定性、黏度、免疫仔豬后的安全性及效力進行了比較。試驗結果表明，以3 000 r/min離心15 min，三種疫苗均無水析出；三種疫苗的黏度均低于200 cP；三種疫苗按2.0 mL/頭的劑量接種21日齡健康易感豬，試驗豬體溫、采食、飲水、精神狀況均正常，均無不良臨床反應，剖檢后各臟器均無病理變化；加強免疫后21 d，各組試驗豬采血，檢測豬圓環病毒2型抗體效價，結果表明，佐劑Montanide ISA 206相較Merckinade SDA 25可誘導更高水平抗體效價。攻毒試驗結果表明免疫組可以得到100％的保護。根據以上試驗結果，確定豬圓環病毒2型滅活疫苗使用Montanide ISA 206。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；滅活疫苗；佐劑；免疫效果

中圖分類號：S858.28 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）04-0056-06

豬圓環病毒引起仔豬低效生產率，是近年來嚴重影響我國養豬業的傳染病之一。該傳染病主要侵害6～8周齡的仔豬，引起仔豬淋巴系統疾病[1]、漸進性體重下降，造成仔豬免疫機能下降、生產性能降低[2]。目前，大部分豬場通過接種疫苗預防和控制豬圓環病毒，現將我們制備的三種豬圓環病毒2型滅活疫苗的安全性和免疫效力進行評估。

1? 材料

1.1 病毒

PCV/SN07-12（微生物保存登記號：CCTCC No：V201304）病毒由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.2 細胞

PK-15細胞（無PCV1污染）由國外引進，并由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所傳代保存。

1.3 試驗動物

21日齡的健康易感豬（豬圓環病毒2型PCR方法檢測PCV2核酸為陰性，豬圓環病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒檢測PCV2抗體為陰性），購自江蘇省鎮江某豬場。

1.4 主要試劑

水包油佐劑Merckinade SDA 25和雙向佐劑Montanide ISA 206購自賽德奧生物科技（北京）有限公司；HS1010佐劑購自杭州洪晟生物技術有限公司；豬圓環病毒 2-dCap ELISA 抗體檢測試劑盒購自廣州銳捷生物科技有限公司。

2? 方法

2.1 半成品的制備

2.1.1 病毒液的制備

PCV2毒種接種于單層PK-15細胞，置37 ℃培養箱中吸附30 min，加入含2％的新生牛血清的DMEM培養液，37 ℃培養箱中繼續培養72 h。收集細胞，－70 ℃反復凍融3次，低溫離心，細胞上清液凍存備用。

2.1.2 抗原滅活

病毒液中加入萬分之二的二乙烯亞胺進行滅活。

2.1.3 半成品檢測

滅活前病毒液中的病毒含量均應大于等于107.0 TCID50/mL；滅活檢驗應無細胞病變，盲傳3代免疫熒光檢測結果應為陰性。滅活前后的無菌檢驗應均為無菌。

2.2 疫苗制備

2.2.1 水包油佐劑Merckinade SDA 25疫苗的制備

將半成品與Merckinade SDA 25以3∶1（質量比）的比例準備，置于磁力攪拌器的燒杯中，300 r/min攪拌，緩緩加入Merckinade SDA 25，在15～35 ℃乳化? 10 min。分裝，2～8 ℃保存備用。

2.2.2 水包油油包水雙向油佐劑Montanide ISA? 206疫苗的制備

取半成品和Montanide ISA 206分別加熱至（30±2）℃，將Montanide ISA 206倒入燒杯中，30 ℃，200 r/min攪拌并逐漸將半成品與Montanide ISA 206以1∶1（質量比）的比例緩慢加入。待滅活抗原全部加入后，攪拌速度提高至2 000 r/min，30 ℃持續攪拌10 min。將容器逐漸降溫，降溫過程中持續攪拌，降溫至15 ℃，停止攪拌，將乳液在15 ℃以下靜置24 h。分裝，2～8 ℃保存 備用。

2.2.3 水包油佐劑HS1010佐劑疫苗的制備

將半成品與HS1010佐劑以5∶1（質量比）的比例混合后在25～30 ℃充分搖勻，即制成豬圓環病毒2型滅活疫苗。分裝，2～8 ℃保存備用。

2.3 穩定性檢驗

取制備的三種疫苗各10 mL于離心管中，以3 000 r/min離心15 min。

2.4 黏度檢驗

將三種疫苗均按2020版《中國獸藥典》[3]附錄進行檢驗。

2.5 無菌檢驗

將三種疫苗均按2020版《中國獸藥典》[3]附錄進行檢驗。

2.6 安全性試驗

2.6.1 分組

將20頭21日齡PCV2陰性（核酸和抗體檢測均陰性）健康仔豬，隨機分入SDA 25佐劑疫苗組、ISA 206佐劑疫苗組、HS1010佐劑疫苗組和空白對照組，每組5頭。試驗豬分別接種用佐劑Merckinade SDA 25 、Montanide ISA 206或HS1010制成的豬圓環病毒2型滅活疫苗或安慰劑，均按組單獨隔離飼養。

2.6.2 接種

三種疫苗分別頸部肌內注射接種一組試驗豬，2.0 mL/頭，對照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。

2.6.3 體溫測定

免疫前3日和免疫后14日內，每天測定各組豬的體溫。

2.6.4 臨床觀察

觀察14日內各組豬的采食、飲水、精神是否正常，有無不良臨床反應，疫苗的吸收情況及注射部位是否有異常反應。

2.6.5 剖檢

免疫后14日，剖殺所有試驗豬，觀察各臟器是否有病理變化。

2.7 效力試驗

2.7.1 分組

將25頭21日齡（PCV2核酸和抗體檢測均陰性）健康易感豬，隨機分為5組，每組5頭，第1～3組為免疫組，試驗豬分別接種3種豬圓環病毒2型滅活苗中的1種；第4組為攻毒對照組，試驗豬接種安慰劑；第5組為空白對照組，試驗豬不接種豬圓環病毒2型滅活苗，也不用豬圓環病毒2型攻毒。各組分離隔離飼養。

2.7.2 免疫組

5頭豬各頸部肌內注射疫苗1.0 mL/頭，一免后14 d用相同劑量加強免疫一次。二免后18 d分別在每頭豬的兩側腋下和兩側臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍蛋白（KLH/ICFA、0.5 mg/mL），每個部位分別注射1.0 mL，每頭合計4.0 mL，同時腹腔接種巰基乙酸培養基，10 mL/頭。

2.7.3? 抗體測定

參照何錫忠等[4]推薦的方法進行抗體測定。

2.7.4 免疫攻毒

參照何錫忠等[4]推薦的方法進行免疫攻毒。

3? 結果

3.1 半成品檢測

滅活前測定病毒液中的病毒含量為? ?107.5 TCID50/mL；抗原滅活檢驗發現無細胞病變，盲傳3代免疫熒光檢測未出現熒光，為PCV2陰性。

3.2 物理性狀檢測

3.2.1穩定性檢驗

三種疫苗經離心后均無水相析出。

3.2.2 黏度檢驗

三種疫苗黏度均小于200 cP，詳見表1。

3.3 無菌試驗

三種疫苗滅活前后均無菌。

3.4 安全性試驗

3.4.1 體溫測定

將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫接種試驗豬，免疫后14 d內每天測定各組試驗豬的體溫。結果表明，三種疫苗免疫組豬及對照組豬的體溫均正常，詳見表2。

3.4.2 臨床觀察

三種疫苗免疫豬后14 d，免疫組豬的采食、飲水、精神狀況均正常，均無不良臨床反應，且疫苗吸收良好，注射部位均無紅腫、硬塊等局部異常反應，與空白對照組豬的無明顯差異，詳見表3。

3.4.3 剖檢

將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫豬。豬接種疫苗后14 d撲殺，觀察各臟器的病理變化。結果表明，3個佐劑疫苗組及對照組豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和淋巴器官均無病理變化，詳見表4。

3.5 效力檢驗

加強免疫后21 d測定各組試驗豬PCV2抗體效價。結果表明，ISA 206和HS1010佐劑疫苗組抗體效價均不低于1∶3 200；SDA 25佐劑疫苗組抗體效價較低，介于 1∶800～1∶3 200；對照組抗體效價不高于1∶400，詳見表5。

4? 結論

豬圓環病毒病的三種疫苗接種仔豬后，仔豬的采食、飲水、體溫均正常，無精神沉郁等，疫苗注射部位均無局部異常。三種疫苗對仔豬兩次免疫后攻毒，免疫豬都得到保護，說明本項目組配制的豬圓環病毒2型滅活疫苗具有良好的免疫效果。該結果與潘杰等[5]的研究結果相一致。對仔豬圓環病毒2型抗體檢測發現，三種疫苗對豬進行兩次免疫后，免疫豬的抗體水平均高于空白對照組豬的，其中Merckinade SDA 25佐劑疫苗產生的抗體水平低于Montanide ISA 206和HS1010佐劑疫苗產生的。考慮到佐劑產品的成熟度最終選用Montanide ISA 206佐劑。

參考文獻

[1] 朱子健，唐志芬，楊金雨，等．豬瘟兔化弱毒疫苗與豬圓環病毒2型滅活疫苗同時接種的免疫效果評價[J]．中國預防獸醫學報， 2017，39（2）：148-151.

[2] 竇鵬勛，葛建強，張勇，等．3種疫苗單獨和聯合免疫對豬抗體水平的影響[J]．安徽農業科學，2009，37（31）：15259-15261.

[3] 中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典（2020版）[S]．北京：中國農業出版社，2021．

[4] 何錫忠，趙本進，林鷙，等．豬圓環病毒2型滅活疫苗安全性及免疫效力的評價[J]．國外畜牧學（豬與禽），2022，42（2）：30-34.

[5] 潘杰，范娟，劉俊斌，等．豬圓環病毒2型滅活疫苗（YZ株）的制備及對仔豬免疫效力的評價[J]．畜牧與獸醫，2017，49（7）：94-98．