復(fù)方骨肽注射液對髁突骨折后大鼠頜骨發(fā)育的影響

蔣騫 陳毅飛 陳雅秋 朱志丹 張嘉杰 孫曉婧

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，桂林 541000；2桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541000；3桂林市口腔醫(yī)院正畸科，桂林 541000

髁突作為顳下頜關(guān)節(jié)的主要承力部位，其頸部骨折占比高達(dá)17.0%～37.1%［1-2］。此時(shí)顳下頜關(guān)節(jié)應(yīng)力改變甚至中斷，會(huì)影響髁突軟骨超微結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致髁突異常發(fā)育［3］。由于骨折愈合需要的時(shí)間較長，在這個(gè)過程中會(huì)出現(xiàn)咬合紊亂、創(chuàng)傷和顏面部不對稱等現(xiàn)象［4-5］。類胰島素一號(hào)生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、血小板衍生生長因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）作為參與髁突軟骨力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)，影響其細(xì)胞增殖代謝及骨折斷端骨增殖分化的細(xì)胞因子，其網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)在代謝轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著極其重要的作用［6-10］。目前，對于處在生長發(fā)育高峰期或之前的髁突骨折患者的治療仍以保守治療為主［11-13］。

注射用骨肽是含有多種骨代謝的活性肽類，具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)新骨形成，防治骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合等效果，臨床上主要作為輔助治療應(yīng)用于四肢骨骨折，可以有效地改善骨折愈合情況，抑制炎性反應(yīng)，增加骨代謝，達(dá)到縮短骨折愈合時(shí)間、減輕術(shù)后疼痛等效果［14-16］。為深入了解髁突骨折后使用復(fù)方骨肽注射液進(jìn)行治療，對頜骨發(fā)育及血清內(nèi)IGF-1、PDGF-BB含量變化的影響，本研究擬建立生長發(fā)育高峰期SD大鼠右側(cè)髁突頸部骨折動(dòng)物模型，觀察各組顳下頜關(guān)節(jié)的形態(tài)、影像學(xué)及血清學(xué)改變。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量為120 g，4周齡，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014；使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3大組，即空白對照組、手術(shù)組和手術(shù)給藥組，隨后每大組分為4小組，即1周齡組、3周齡組、5周齡組、9周齡組，每組6只。全部大鼠飼養(yǎng)在無病原體的環(huán)境中，喂養(yǎng)和建模過程得到了桂林醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)為KQDW-20210003），并遵循了3R原則等所有有關(guān)動(dòng)物倫理使用的適用機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)給予人道主義關(guān)懷。

2.主要試劑及儀器

主要試劑：復(fù)方骨肽注射液（吉林輝南長龍），規(guī)格2 ml/10 mg；PDGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；IGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；2%戊巴比妥鈉（上海恩化化學(xué)技術(shù)有限公司）；多聚甲醛溶液（北京蘭杰柯科技有限公司）。

主要儀器：小動(dòng)物活體成像儀（美國PerkinElmer，IVIS Lumina Ⅲ）、高速離心機(jī)（德國Eppendorf，5424R）、多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek，EL×800）、游標(biāo)卡尺（0.02mm分辨率）、鑷子、金冠剪等由桂林醫(yī)學(xué)院提供。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1.動(dòng)物編號(hào) 每組按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顏料涂擦被毛編號(hào)法，用3%苦味酸溶液進(jìn)行編號(hào)。

3.2.動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)于2019年10月25號(hào)開始，空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型。術(shù)前記錄大鼠體質(zhì)量，術(shù)前8 h禁食，2%戊巴比妥納（0.2 ml/kg）行腹腔注射麻醉。待無角膜反射后即可開始手術(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中注意動(dòng)物的反應(yīng)，適時(shí)追加0.1 ml麻醉劑以維持麻醉效果。取左側(cè)臥位固定大鼠，常規(guī)脫毛、消毒。待干燥后右耳前縱切口，切開皮膚、皮下組織。拉開腮腺，從顳肌、咬肌及外耳道之間的凹陷處入手。鈍剝離暴露髁頸部，用眼科剪剪斷髁頸造成骨折（圖1）。手術(shù)過程中注意避讓附近血管和神經(jīng)，分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后2 d內(nèi)給予精細(xì)食物與常規(guī)飼料的混合喂養(yǎng)，之后恢復(fù)常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

圖1 大鼠髁突頸部骨折造模（箭頭處為手術(shù)骨折端）

3.3.藥物干預(yù) 手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液。依據(jù)體表面積算法換算大鼠的等效劑量為每日用藥量0.9 mg/kg，將復(fù)方骨肽注射液（2 ml/10 mg）溶于98 ml生理鹽水中，按照大鼠體質(zhì)量行腹腔注射。空白對照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射。

3.4.血清樣本的收集 將3組大鼠分別于術(shù)后1、3、5、9周各取6只，進(jìn)行眼球取血。將大鼠頭部朝斜下固定住，剪掉大鼠胡須及眼眶周圍的鼠毛，待眼球充分充血后，用鑷子快速夾掉大鼠眼球。用EP管收集全血，于試管架上做好標(biāo)記后室溫靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，離心半徑9 cm，后取上方血清分裝于冰箱-20 ℃保存以待檢測。

3.5.解剖標(biāo)本采集與保存 將3組大鼠分別于術(shù)后1、3、5、9周各取6只，進(jìn)行眼球取血后，腹腔注射2%戊巴比妥納（0.6 ml/kg）行大鼠安樂死。隨后斷頭，去皮，手術(shù)結(jié)束后，統(tǒng)一將大鼠頭部沿正中矢狀面一分為二，取左右側(cè)下頜骨作為檢驗(yàn)標(biāo)本，修整標(biāo)本，按照組別分類標(biāo)號(hào)后，4%甲醛浸泡。

3.6.觀測與檢驗(yàn)方案 （1）下頜骨的解剖學(xué)觀測測量3組組織標(biāo)本的下頜骨，使用分規(guī)卡尺和游標(biāo)卡尺（0.02 mm分辨率）測量以下解剖結(jié)構(gòu)標(biāo)志。下頜體長度（Id-Ap）：下頜角點(diǎn)至下齒槽緣點(diǎn)的距離；下頜體高度（TM-AN）：角前切跡至下頜磨牙遠(yuǎn)中的距離；下頜升支高度（Co-Ap）：下頜角點(diǎn)至髁頂點(diǎn)的距離，1個(gè)標(biāo)本上每個(gè)解剖標(biāo)志的距離測量3次，求平均值，由1人完成。觀測下頜骨的生長發(fā)育情況。（2）顳下頜關(guān)節(jié)的影像學(xué)觀察使用小動(dòng)物活體成像儀，用X-ray攝片，觀察3組的下頜骨形態(tài)和骨折線愈合情況。（3）檢驗(yàn)血清內(nèi)的IGF-1、PDGF-BB含量采用血清學(xué)夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測標(biāo)本血清內(nèi)IGF-1、PDGF-BB含量。利用酶標(biāo)儀、恒溫箱等實(shí)驗(yàn)儀器，分別按照IGF-1、PDGF-BB檢測試劑盒檢測各組SD大鼠血清中IGF-1、PDGF-BB的含量。檢測流程：配制標(biāo)準(zhǔn)曲線、加樣后反應(yīng)、加抗體后反應(yīng)、洗板、加ABC工作液后反應(yīng)、洗板、加TMB顯色液后避光反應(yīng)、加終止液。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用各組均數(shù)比較，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.下頜骨生長觀察結(jié)果（圖2）

圖2 各組大鼠生長長度比較（樣本量=6）

通過對空白對照組右側(cè)標(biāo)本、手術(shù)組左側(cè)標(biāo)本、手術(shù)組右側(cè)標(biāo)本、手術(shù)給藥組右側(cè)標(biāo)本進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)TM-AN、Co-Ap、Id-Ap在術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組比較，呈現(xiàn)出空白對照組大于手術(shù)組左側(cè)，手術(shù)組左側(cè)與手術(shù)給藥組右側(cè)相近，手術(shù)給藥組右側(cè)大于手術(shù)組右側(cè)的結(jié)果。其中，對照組右側(cè)、手術(shù)組左側(cè)、手術(shù)組右側(cè)的TM-AN、Co-Ap、Id-Ap在術(shù)后1、3周比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。給藥組的Id-Ap在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但TM-AN和Co-Ap僅在術(shù)后1、3周差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。繪制各組TM-AN、Co-Ap、Id-Ap的距離均數(shù)柱狀圖可見，各組下頜骨生長均表現(xiàn)為遞增狀態(tài)，但手術(shù)組右側(cè)生長變化低于其他組，手術(shù)給藥組右側(cè)生長變化與手術(shù)組左側(cè)相近。

2.下頜骨影像學(xué)觀察結(jié)果（圖3）

圖3 各組髁突頸部骨折大鼠骨折下頜骨X片

在術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)組左側(cè)及空白對照組右側(cè)下頜骨影像密度均勻連續(xù)，手術(shù)組及手術(shù)給藥右側(cè)骨折線均清晰可見骨折斷端密度不均，骨折線內(nèi)見高密度影像，邊界模糊。術(shù)后3周時(shí)大鼠髁突頸部骨折線邊界手術(shù)組較手術(shù)給藥組模糊，手術(shù)給藥組的骨折邊界線逐漸消失。術(shù)后5周大鼠下頜骨形態(tài)逐漸恢復(fù)，手術(shù)組骨折邊界逐漸消失，手術(shù)給藥組未見骨折邊界線。手術(shù)組大鼠在術(shù)后9周時(shí)下頜骨影像密度趨于均勻。

3.血清PDGF-BB水平（表1）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清血小板衍生生長因子-BB水平比較（ng/L，）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清血小板衍生生長因子-BB水平比較（ng/L，）

注：空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型，手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液，空白對照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射；表中同一列數(shù)值有相同肩標(biāo)字母表示P＜0.05

術(shù)后9周370.81±78.81ab 188.74±22.51a 202.79±51.77b組別手術(shù)組手術(shù)給藥組空白對照組樣本量6 6 6術(shù)后1周104.21±15.01a 241.69±22.49a 406.47±26.88a術(shù)后3周487.6±141.76a 337.37±51.28b 718.4±153.52ab術(shù)后5周432.61±33.03a 438.16±63.43b 348.65±68.24ab

分析各組大鼠生長過程中血清PDGF-BB水平的測定結(jié)果得出：3組PDGF-BB含量均呈先上升后下降趨勢。相同周齡的3組大鼠血清內(nèi)PDGF-BB的含量兩兩比較得出：術(shù)后1周時(shí)，空白對照組大鼠的血清PDGF-BB含量高于手術(shù)給藥組、手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；術(shù)后3～5周時(shí)，手術(shù)組、手術(shù)給藥組分別與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P3周=0.006、＜0.001，P5周=0.022、0.016）；術(shù)后9周時(shí)，手術(shù)組含量最高，手術(shù)給藥組與空白對照組相近，此時(shí)手術(shù)組與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

4.血清IGF-1水平（表2）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清類胰島素一號(hào)生長因子水平比較（ng/L，）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清類胰島素一號(hào)生長因子水平比較（ng/L，）

注：空白組不予以處理，手術(shù)組和手術(shù)給藥組建立大鼠單側(cè)髁突頸部骨折的動(dòng)物模型，手術(shù)給藥組術(shù)后每天注射復(fù)方骨肽注射液，空白對照組和手術(shù)組給予等量生理鹽水行腹腔注射；表中同一列數(shù)值有相同肩標(biāo)字母表示P＜0.05

術(shù)后9周1 413.96±227.77a 1 525.63±153.13b 304.92±212.84ab組別手術(shù)組手術(shù)給藥組空白對照組樣本量6 6 6術(shù)后1周2 036.87±121.73a 2 048.85±133.19b 3 989.05±106.05ab術(shù)后3周3 133.14±320.36a 2 318.26±440.46ab 3 299.01±510.28b術(shù)后5周2 109.95±181.74a 2 714.89±180.21a 2 499.27±186.04a

分析各組大鼠生長過程中血清IGF-水平的測定結(jié)果得出：空白對照組IGF-1的含量呈逐步下降趨勢，但手術(shù)組與手術(shù)給藥組均為先上升后下降趨勢。術(shù)后1周時(shí)，空白對照組與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；術(shù)后3周時(shí)，手術(shù)組血清IGF-1含量達(dá)到頂峰，與空白對照組相近，手術(shù)組、空白對照組分別與手術(shù)給藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005、0.001）；術(shù)后5周時(shí)，手術(shù)給藥組血清IGF-1的含量達(dá)到峰值，3組含量兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006、0.024）；術(shù)后9周時(shí)，空白對照組含量低于其余兩組（P＜0.001），手術(shù)組與手術(shù)給藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.165）。

討論

髁突頸部骨折是口腔頜面外科的高發(fā)骨折類型之一。在臨床上，其治療方式要考慮髁突骨折時(shí)所受到的作用力方向、大小以及個(gè)體年齡等差異［17-18］。若處于生長高峰期之前的兒童或正處于生長高峰期的青少年在下頜骨尚未發(fā)育完全的情況下出現(xiàn)髁突骨折，而髁突作為下頜骨主要生長發(fā)育中心之一，此時(shí)髁突所受到的應(yīng)力刺激改變或中斷將導(dǎo)致下頜骨發(fā)育暫停或緩慢［19］。復(fù)方骨肽注射液是用動(dòng)物胎骨制成，具有多種促進(jìn)骨生長、骨發(fā)育等活性物質(zhì)。近年來，復(fù)方骨肽注射液在臨床上常常作為輔助治療藥物用于促進(jìn)四肢骨骨折的愈合。但骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，會(huì)受到各種外界因素、個(gè)體差異、骨折區(qū)血供、軟組織損傷程度等影響［20］。

本研究選擇的是處于生長發(fā)育高峰期的雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明。⑴空白對照組在術(shù)后4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)TM-AN、Co-Ap、Id-Ap均大于其他2組，表明單側(cè)髁突骨折會(huì)對大鼠下頜骨的生長發(fā)育帶來影響；手術(shù)組左側(cè)（正常側(cè)）大于右側(cè)（骨折側(cè)），這意味著手術(shù)組下頜骨因右側(cè)髁突骨折造成雙側(cè)髁突受力不平衡，左側(cè)受到咀嚼等應(yīng)力刺激增加，使下頜骨左側(cè)的生長發(fā)育快于右側(cè)，下頜骨偏斜至患側(cè)。手術(shù)給藥組的生長距離與手術(shù)組左側(cè)相近，大于手術(shù)組右側(cè)，說明復(fù)方骨肽注射液能促進(jìn)髁突骨折愈合，降低下頜骨的偏斜程度。⑵影像學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手術(shù)給藥組在術(shù)后5周時(shí)就能使骨折斷端基本愈合，這種現(xiàn)象在手術(shù)組術(shù)后9周時(shí)才出現(xiàn)，說明骨肽在一定程度上能促進(jìn)骨折斷端的愈合。⑶血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)給藥組血清PDGF-BB含量比手術(shù)組高，可能是骨肽注射液刺激了機(jī)體內(nèi)PDGF-BB的表達(dá)，而空白組血清IGF-1含量與其他2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明手術(shù)和藥物處理對IGF-1的影響已經(jīng)開始；術(shù)后5周時(shí)，手術(shù)給藥組的血清PDGF-BB和IGF-1的含量比其他2組高且達(dá)到峰值，這可能是由于骨肽加速了骨折愈合過程中生長因子的表達(dá)，但具體作用機(jī)制還有待研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，手術(shù)和藥物處理都會(huì)對大鼠血清IGF-1含量產(chǎn)生影響，并且這種影響是動(dòng)態(tài)的，不同時(shí)間點(diǎn)的影響不同。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究髁突骨折和骨肽對大鼠生長和恢復(fù)的影響提供了重要的信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔣騫：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，工作支持；陳毅飛：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，統(tǒng)計(jì)分析，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；陳雅秋、朱志丹：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析，行政、技術(shù)或材料支持；張嘉杰：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，起草文章，獲取研究經(jīng)費(fèi)；孫曉婧：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)