基于網絡藥理學預測桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用機制

王敏潔，徐傳花

（1.南京中醫藥大學研究生院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬醫院常州市中醫醫院婦科，江蘇 常州 213000）

盆腔炎性疾病后遺癥（sequelae of pelvic inflammatory disease，sequelae of PID）是盆腔炎性疾病（pelvic inflammatory disease，PID）的病變遺留，包括復發性盆腔炎、慢性盆腔痛、異位妊娠和不孕癥等。據文獻報道[1]，長期后遺癥的發生率很高。極大地影響了育齡婦女的生殖健康，降低了婦女的生活質量。該病目前主要治療方法是聯合抗生素，但長期使用抗生素面臨耐藥性增加、療效降低的風險[2]。因此，中醫藥治療盆腔炎性疾病后遺癥具有明顯優勢。中醫并沒有盆腔炎性疾病后遺癥的名稱記載。根據其臨床表現，可分為“癥瘕”“婦女腹痛”“白帶”“月經不調”“不孕”等類。根據中醫學理論，該病以血瘀為基礎。桂枝茯苓丸是《金匱要略》中的經典方劑，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍五味藥組成，具有活血化瘀、消癥止痛、調理氣血的功效，為婦人宿有癥瘕病、癥留胞宮、妊娠胎動不安、漏下不止的主方[3]。通過數據挖掘分析，張崴等[4]發現桂枝茯苓方在臨床應用治療女性生殖系統疾病的文獻中排名靠前。然而，目前對桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用機制的研究尚少。網絡藥理學利用數據挖掘方法分析藥物多成分、多靶點、多途徑之間的相互作用。本文利用數據可視化分析方法，預測了藥物在疾病治療中的作用機理，并利用該網絡研究了中藥的作用機理為相關實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “桂枝茯苓丸”藥物化學成分及其相關靶點的收集 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）搜索桂枝茯苓丸的有效成分，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-like，DL）≥0.18 的標準篩選所有有效成分，將過濾過的化合物輸入Uniport 數據庫（https://www.uniprot.org/）。確定物種為人（Human），范圍為已驗證（Reviewed），尋找相應的靶點蛋白，獲得遺傳基因名稱、Uniport ID 等信息。

1.2 疾病相關靶點與藥物—疾病交集靶點 通過人類基因數據庫收集盆腔炎性疾病后遺癥的疾病靶點，使用的關鍵詞為“sequelae of PID”。收集到的目標導入到UniProt 數據庫標準化處理。將“桂枝茯苓丸”的有效成分相關的靶點和“盆腔炎性疾病后遺癥”的疾病靶點導入到Venny 2.1.0 中，獲得藥物-疾病交叉靶點和Venn 圖。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點網絡構建 以桂枝茯苓丸的有效成分靶點和盆腔炎性后遺癥疾病靶點為基礎，構建藥物-活性成分-靶點-疾病Excel 文件，導進Cytoscape3.8.0 構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖，從而查明桂枝茯苓丸及其活性成分、靶點與疾病的關系。

1.4 藥物-疾病蛋白相互作用網絡構建 將藥物和疾病的交叉靶點導入STRING 軟件（https://string-db.org/）中，物種僅局限于人（homo sapiens），查看并保留蛋白質相互作用關系≥0.4 數據，結果以TSV 格式導出，并使用Cytoscape 3.8.0 軟件建立蛋白質相互作用（PPI）網絡圖。

1.5 GO 生物功能及KEGG 信號通路富集分析 利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對藥物與疾病交叉靶點進行京都基因與基因組百科全書信號通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體生物學過程分析（gene ontology，GO）。將標準設置為P小于0.05，將P-value 最小的GO 生物功能及KEGG 信號通路前20 條結果制成氣泡圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 “桂枝茯苓丸”藥物化學成分及其相關靶點 利用TCMSP 進行檢索，并設定OB≥30%、DL≥0.18，篩選得到桂枝茯苓丸組方藥物活性成分，其中桂枝7 個、茯苓15 個、牡丹皮11 個、白芍13 個、桃仁23 個，合并去重后共59 個。其中共有成分有7 個，見表1。借助TCMSP、Uniport 進行靶基因預測，刪除沒有靶基因的成分23 個，最終獲得化學成分36 個，對應候選靶點187 個，部分候選靶點見表2。

表1 桂枝茯苓丸中各個藥物的共有活性成分

2.2 “盆腔炎性疾病后遺癥”疾病靶點的搜集結果通過GeneCards 數據庫并結合相關文獻，獲得疾病靶點199 個。將桂枝茯苓丸藥物成分相關靶點、盆腔炎性疾病后遺癥疾病相關靶點導入Venny 2.1.0在線作圖工具，共獲得38 個交集靶點及韋恩圖，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸-盆腔炎性疾病后遺癥交集靶點及韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網絡構建 將藥物-活性成分-靶點-疾病Excel 文件導入Cytoscape 3.8.0 軟件并進行映射，構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖，見圖2。該網絡共71 個節點，包括1 個藥方節點、5 個藥物節點、26 個活性成分節點、38 個作用靶標節點及1 個疾病節點，164 條邊。利用Cytoscape軟件中的NetworkAnalyzer 分析工具得出有效成分的Degree 值，見表3。

圖2 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖

表3 桂枝茯苓丸藥物有效成分及OB、DL 值（Degree 值前7 位）

2.4 藥物-疾病蛋白相互作用網絡構建 將藥物-疾病的38 個交集靶點導入STRING 軟件中，設置置信度為Score≥0.400，導出TSV 數據文件，導入Cytoscape 3.8.0 軟件，共得到38 個節點，810 條邊，平均節點度值為42.6，連接度越大，靶點越關鍵，見圖3。利用EXCEL 計算桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥PPI 網絡中靶點的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）值，以不小于DC（42.63 157 895）、BC（0.012 407 144）、CC（0.715 035 917）平均值為條件，篩選得到PPI 網絡的核心基因，IL6、TNF、IL1β、CCL2、TP53、IL10、EGFR、FOS、CRP 等。核心靶點蛋白互作PPI 網絡圖見圖4，提示其可能是桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的重要作用靶點。

圖3 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點蛋白互作（PPI）網絡圖

圖4 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥核心靶點蛋白互作（PPI）網絡圖

2.5 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點GO 生物功能富集分析結果 采用DAVID 數據庫對桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點進行GO 生物功能富集分析，共獲得P值小于0.05 的GO功能條目123 條，包括生物過程（biological process，BP）86 條，細胞組分（cellular component，CC）11 條，分子功能（molecular function，MF）26 條。生物過程主要在炎癥應答、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、脂多糖細胞的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調控、免疫應答等方面；細胞組分主要富集在細胞外間隙、胞外區、外側細胞膜、細胞表面、內質網膜等；分子功能主要富集在細胞因子活性、蛋白作用活性、受體信號轉導蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結合、轉錄因子結合、生長因子活性等，見圖5。

圖5 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點GO 分析

2.6 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點KEGG 信號通路富集分析結果 通過DAVID 數據庫對桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點進行KEGG 信號通路富集分析，共獲得P 值小于0.05 的KEGG 信號通路71 條，根據P值對前20 條信號通路繪制氣泡圖，見圖6。前10 位信號通路富集細節，見表4。

圖6 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點KEGG 分析

表4 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥前10 位信號通路富集細節

3 討論

盆腔炎性疾病后遺癥持續時間長且難以治愈。盆腔炎的發生發展經歷了病原體感染、宿主免疫系統激活和抗感染因子釋放3 個階段[5]。本研究采用網絡藥理學方法，通過數據可視化分析發現，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、（+）-兒茶素等成分可能是治療盆底炎性疾病后遺癥的關鍵藥物成分。通過藥物-疾病作用靶點富集分析結合相關文獻的分析，發現桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的關鍵靶點基因是白細胞介素6（interleukin6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素1-β（interleukin 1-β,IL1β）、趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、細胞腫瘤抗原（Cellular tumor antigen p53，TP53）等。

槲皮素和山萘酚均為黃酮類化合物。大量文獻報道黃酮類化合物可抑制IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α，從而發揮抗炎作用。槲皮素的抗炎機制是抑制炎癥因子的形成[6，7]。山奈酚可以減少炎癥因子的產生，如巨噬細胞衍生趨化因子（macro phage derived chemokine，MDC）、干擾素誘導蛋白-10（interferon induced protein -10，IP-10）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等，發揮抑制炎癥的作用[8，9]，從而促進人體健康，預防癌癥、慢性炎癥、糖尿病、神經退行性疾病、骨質疏松等疾病。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇其抗炎作用是通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3 的激活，減少CAS1 的產生及MAPK 信號通路的活化，最終造成細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 生成顯著減少的結果[10，11]。兒茶素在清除自由基、調節細胞信號通路和作用于氧化酶方面發揮抗氧化作用[12]。趨化因子是具有細胞招募功能的小分子蛋白質。當炎癥、損傷和病原體入侵在體內發生時，趨化因子的表達增加，免疫細胞被招募到受損部位，導致身體產生免疫反應[13]。通過對桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用靶點進行KEGG 富集分析，結合相關文獻，發現腫瘤壞死因子信號轉導通路、Toll 樣受體信號通路、腫瘤信號通路和MAPK 信號通路是盆腔炎性疾病后遺癥治療的關鍵通道。基于網絡藥理學和分子對接驗證，張新莊等研究了桂枝茯苓膠囊治療痛經、子宮肌瘤、盆腔炎的分子機制，推測桂枝茯苓膠囊可能通過多種成分作用于多種生物通路，抑制子宮平滑肌增殖、促進子宮內膜血管生成和血液循環、減少雌激素和孕激素的分泌、子宮平滑肌肉收縮和前列腺素等炎癥因子的合成或釋放，從而緩解痛經、減輕子宮肌瘤引起的炎癥和疼痛、減少炎癥反應，進一步提高患者的生活質量[14，15]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法，發掘和闡述桂枝茯苓丸的有效成分及其治療盆腔炎性疾病后遺癥的多成分、多靶點、多途徑的機制，并初步推斷桂枝茯苓丸可能通過槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、（+）-兒茶素等活性成分作用于IL-6、TNF、IL1β、CCL2、TP53 等關鍵靶點基因通過抗氧化、抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞生長等作用機制，最終達到治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用。然而，這項研究還存在一些不足之處，需要后期進一步的實驗驗證。