基于血管新生途徑探討銀杏蜜環口服溶液對光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型皮質損傷的影響?

姚明江,張業昊,王光蕊,任鈞國,王益民,王 勇,赫少清,劉建勛△

(1.中國中醫科學院西苑醫院,北京 100091;2.中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091;3.西安步長中醫心腦病醫院,西安 710082)

缺血性腦卒中(腦梗死)在所有卒中類型中占比約70%～80%,以發病率高、病死率高及致殘率高為主要特征,嚴重影響患者生命安全與生活質量[1-2]。研究顯示,血管新生是腦梗死后神經修復的基礎,可通過增加缺血區域血流灌注為神經修復提供營養物質與氧氣供應,起到改善腦梗死的作用[3-4]。

銀杏蜜環口服溶液(YinxingMihuanoral solution,YM)是由銀杏葉提取物和蜜環粉組成的復方制劑,用于改善心、腦缺血癥狀及與微循環障礙相關的疾病[5-6]。課題組前期細胞實驗表明,YM具有體外誘導血管新生與促進多種血管生成相關因子表達的作用,但仍缺乏動物實驗的證據[7]。

腦梗死根據發病機制的不同可分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等不同類型,其中腦血栓形成最為常見[8-9]。光化學誘導血栓形成腦梗死模型(photothrombolic stroke,PTs)基于血管內光氧化,導致明顯的皮質局限性缺血性損傷,與臨床血栓形成的機制較為契合,是一種常見的腦缺血動物模型[10]。本研究以該動物模型為研究對象,進一步闡明YM對腦梗死后血管新生的改善作用與機制,為該藥臨床治療缺血性腦血管病提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠(23±1)g,由北京斯貝福生物技術有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2016-0002。動物購進后飼養于屏障環境,自由攝食飲水,12 h晝夜循環(7:00-19:00),室溫(23±2)℃,相對濕度為50%～60%。實驗操作過程嚴格遵守科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》,并通過中國中醫科學院西苑醫院實驗動物倫理委員會審查,批準編號2022XLC048-2。

1.2 藥物與試劑

YM(10 mL/支,邛崍天銀制藥有限公司,批號:190721);銀杏葉提取物片(商品名:金納多,40 mg/片,德國威瑪舒培博士藥廠,批號:8411015);戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司,批號:020402);玫瑰紅(北京索萊寶生物科技有限公司,批號:425D042);CD31兔多克隆抗體(英國Abcam公司,貨號:ab124432),血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)兔多克隆抗體(美國Proteintech公司,貨號:11778-1-AP);SABC免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:SPN-9001);TRIzol 總RNA提取試劑(美國ThermoFisher公司,貨號:15596-018),反轉錄試劑盒(日本TOYOBO東洋紡株式會社,貨號:FSQ-201),實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒(美國ThermoFisher公司,貨號:4367659);血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α及血管生長素(angiogenin,ANG)及β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計與合成。

1.3 儀器

HW520AD12-16GD型520 nm 12 mW點狀冷光激光發射器(深圳市紅外線激光科技有限公司);PeriCam PSI型激光散斑腦血流灌注成像儀(瑞典帕瑞醫學公司);SYNERGYTM 4型多功能酶標儀(美國BioTek公司);ICE-CL31R型低溫離心機(美國Thermo Scientific公司);BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司);Ⅸ53型顯微鏡(日本Olympus公司);QL-902型渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);SMA-1000型超微量紫外分光光度計(美林恒通儀器有限公司),T-GRADIENT型溫度梯度PCR儀(德國Biometra公司);ABI StepOnePlus型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型的建立

參照文獻方法建立PTs模型[11-12]:0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射0.1 mL/10 g麻醉小鼠,玫瑰紅采用0.9%氯化鈉溶液配制成10 mg/mL,通過尾靜脈以0.1 mL/10 g體質量注射,5 min后沿中線切開小鼠顱頂皮膚,固定于立體定位儀上,采用冷光激光發射器對小鼠顱骨部位進行垂直激光照射,圓形光斑直徑4 mm,光斑中點距前囪右側2.0 mm、后側2.0 mm,激光頭距離小鼠顱骨2.0 cm,照射時間7 min,隨后縫合顱頂皮膚。整個實驗過程采用加熱墊維持小鼠體溫于(37.0±0.5)℃。另外設置假手術組,亦注射玫瑰紅溶液,但不對其進行激光照射。

2.2 分組與給藥

實驗分為假手術組、模型組、陽性藥金納多組(12.5 mg/kg)、YM低劑量組(YM低劑量組,412 mg/kg)和YM高劑量組(YM高劑量組,824 mg/kg)。小鼠腦梗死模型術后第2天開始每天灌胃給藥1次,連續給藥14 d,假手術組與模型組按0.1 mL/10 g灌胃蒸餾水,其余各給藥組分別按0.1 mL/10 g灌胃給予相應藥物。

2.3 小鼠體質量與神經功能缺陷評分

給藥后1 d、3 d、7 d及14 d(處死前)各稱量一次動物體質量,并采用Zea Longa評分標準對小鼠進行神經功能缺損情況評分[13-14]。0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發行走,意識喪失。

2.4 在體腦血流灌注量測定

各組小鼠給藥后14 d(處死前)進行全部行為學指標檢測后,腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉,采用激光散斑腦血流儀監測各組小鼠腦血流灌注量,固定探頭,記錄缺血側相當于激光光斑直徑大小區域(固定ROI大小)腦血流降低的百分比(變化率,△ROI%),△ROI%=(健側腦血流-缺血側腦血流)/健側腦血流。

2.5 取材

各組小鼠稱量體質量,以0.5%戊巴比妥鈉麻醉,迅速斷頭取腦。每組取部分鼠腦(6只/組)即刻完整投入10%中性福爾馬林溶液中固定24 h,選取缺血灶部位修塊,常規脫水、透明、浸蠟、包埋,將蠟塊切成4 μm厚冠狀切片,以備免疫組化染色;每組剩余小鼠腦(4只/組)選取缺血灶及缺血周邊區域皮質部位腦組織,投入液氮速凍,轉移至-80 ℃冰箱,以備提取RNA進行RT-qPCR檢測。

2.6 免疫組化法檢測CD31及vWF蛋白表達

對石蠟切片進行免疫組化染色,嚴格按照SABC試劑盒說明書操作。CD31、vWF抗體分別按1:200、1:100倍稀釋。結果判定:陽性信號呈棕黃色顆粒。圖像分析及定量:光鏡10×20倍下,每組選取6張切片,每張切片選取5個不同視野,應用ImagePro Plus 6.0圖像處理系統對缺血周邊區域(infarct border zone,IBZ)皮質部位進行陽性表達平均光密度值測定(IOD/area)。

2.7 RT-qPCR法檢測VEGF、HIF-1α及ANG mRNA表達

采用TRIzol法提取缺血灶及缺血周邊區域皮質部位腦組織總mRNA,經純度、濃度檢測后,使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA,隨后采用RT-qPCR法檢測VEGF、HIF-1α及ANG mRNA表達,內參基因為β-actin,擴增條件如下:95 ℃,30 s(預變性);95 ℃,5 s,60 ℃,40 s,收集熒光(40個循環),擴增反應結束后,建立產物熔解曲線。每例樣品檢測3個復孔。VEGF上游引物序列:TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC,下游引物序列CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA;HIF-1α上游引物序列GAATGAAGTGCACCCTAACAAG,下游引物序列GAGGAATGGGTTCACAAATCAG;ANG上游引物序列AAGAGAAGAAGCCTAACCTCAC,下游引物序列TTTCTCTGTAAGGGCTTCCATT;內參β-actin上游引物序列CTACCTCATGAAGATCCTGACC,下游引物序列CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC。采用2-△△CT法計算IBZ區皮質組織VEGF、HIF-1α及ANG mRNA相對表達水平。

2.8 統計學處理

3 結果

3.1 YM對光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型體質量、神經功能評分的影響

與假手術組比較,給藥后1 d及3 d,模型組小鼠體質量明顯減輕(P<0.01)。與模型組比較,給藥后3 d,YM低、高劑量組小鼠體質量增長明顯(P<0.01)。至7 d及14 d,各組動物體質量逐漸恢復,模型組與假手術組比較、各給藥組與模型組比較差異均無統計學意義,結果見表1。

假手術組無神經功能缺損癥狀。給藥后各時間點,模型組小鼠神經功能缺損評分明顯上升(P<0.01),并隨著時間增加有逐漸下降的趨勢。與模型組比較,YM高劑量組在給藥后14 d神經功能缺損評分明顯下降(P<0.05),其余各給藥組在各時間點神經功能缺陷評分與模型組比較,差異無統計學意義,結果見表2。

表2 給藥后1 d、3 d、7 d、14 d各組小鼠神經功能缺損評分比較

3.2 YM對光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型腦血流灌注量的影響

各組動物給藥后14 d,采用激光散斑腦血流儀監測各組小鼠腦血流量變化率,結果見圖1,與假手術組比較,模型組小鼠腦血流變化率明顯增加(反映腦血流明顯下降,P<0.01),金納多組與YM高劑量組可顯著降低小鼠腦血流變化率(P<0.05),結果見表3。

圖1 激光散斑腦血流儀檢測各組小鼠腦血流灌注量

表3 各組小鼠腦血流灌注量變化率比較

3.3 YM對光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型CD31及vWF蛋白表達的影響

免疫組化法染色結果如圖2所示,模型組小鼠皮質缺血周邊區域可見明顯的呈棕黃色的CD31與vWF陽性表達細胞,其平均光密度與假手術組比較顯著升高(P<0.01)。金納多組CD31及vWF蛋白表達均進一步上調(P<0.05),而YM低劑量組明顯上調CD31蛋白表達(P<0.05),YM高劑量組明顯上調vWF蛋白表達(P<0.05),結果見表4。

圖2 各組小鼠皮質區CD31及vWF免疫組化染色結果

表4 各組小鼠皮質區CD31及vWF蛋白表達平均光密度比較

3.4 YM對光化學誘導血栓形成致小鼠腦梗死模型腦組織VEGF、HIF-1α及ANG mRNA表達的影響

RT-qPCR法檢測結果如表5所示,與假手術組比較,模型組小鼠缺血周邊區域皮質區HIF-1α及ANG mRNA表達明顯上調(P<0.05)。與模型組比較,YM高劑量組能顯著上調VEGF、HIF-1α及ANG mRNA表達(P<0.05,P<0.01)。

表5 各組小鼠皮質區組織VEGF、HIF-1α及ANG mRNA表達比較

4 討論

腦缺血的發生是鈣超載、炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等多重病理環節交互的結果,然而目前仍缺乏有效的促進缺血性卒中后功能恢復的治療藥物[15]。血管新生是指在原有血管基礎上通過血管內皮細胞增殖、游走、芽生,血管分裂、分支而形成新的毛細血管網的生物學過程,是缺血區組織抗損傷和神經元修復的結構基礎,在腦損傷后的修復過程中起重要作用[16-17]。動物缺血性腦卒中后存在代償性的血管新生,但常常不足以恢復腦損傷,通過藥物促進血管新生成為促進缺血后神經功能康復的策略之一。

YM是臨床上市藥物,基礎與臨床研究表明,治療缺血性腦卒中療效肯定,具有治療腦梗死、保護神經細胞的作用[18-19]。課題組前期體外實驗表明,YM可誘導血管新生,同時促進多種血管生成相關因子的表達,對氧糖剝奪/復氧復糖損傷的腦微血管內皮細胞具有促增殖、提高遷移率的作用。本研究在此基礎上,在動物水平對YM促血管新生作用進行了初步探索。

本研究采用PTs模型,該模型通過提前向動物血液中注射光敏感的染料如玫瑰紅(rose bengal)等,然后采用特定波長的冷光源進行激發,使光照局部的染料釋放出活性氧產物,誘導內皮細胞膜的過氧化以及血小板的黏附與聚集,最終導致該部位血栓形成,造成局部腦血流中斷,從而出現皮質局灶性的梗死[20]。激光散斑襯比成像(laser speckle contrast imaging,LSCI)具有高時空分辨率、創傷性小等優點,特別適用于對腦缺血后側支循環的建立與開放情況、新生血管的生成情況以及血液微循環灌注情況等的評價[21]。本研究結果顯示,造模后動物體質量減輕,且出現明顯的神經功能缺損、腦血流量降低等缺血性改變,取材時亦可見明顯的腦皮質局灶性梗死區,說明成功建立了PTs模型。

血小板內皮細胞黏附分子CD31是內皮前體細胞特異性標志物,是反映微血管密度和側支循環建立情況的糖蛋白,與血管新生過程密切相關,在腦缺血梗死周圍顯著增加[22]。此外,還有多種活性因子參與腦缺血后的血管新生過程,如vWF、VEGF、HIF-1α及ANG等,都被認為是缺血后血管新生的關鍵基因與中樞性介質,并且相互影響,相互促進,具有協同作用,有助于缺血區新生血管的形成和受損腦組織功能的恢復[23-29]。本研究結果顯示,模型組動物缺血灶周圍區域CD31及vWF蛋白表達顯著增強;缺血側腦皮質組織HIF-1α、ANG mRNA表達不同程度上調,提示模型組缺血灶周圍區域存在一定程度的內皮細胞的增殖分化及血管新生,以代償缺血區血供不足的功能。

本研究結果還顯示,YM可進一步改善模型小鼠神經功能缺損情況以及腦血流的灌注量,血管新生相關指標CD31、vWF的蛋白表達及VEGF、HIF-1α、ANG mRNA表達也較模型組有不同程度上調,提示YM液對缺血性腦損傷的治療作用可能與調節血管新生相關因子表達,促進血管新生從而修復神經損傷有關。課題組將在后續研究中進一步闡明YM對血管新生的作用及機制,為該藥臨床治療腦梗死提供更充足的實驗依據。