“雙固一通”電針預處理對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠細胞凋亡的機制研究?

陳 佳,韓永麗,陳 松,陳子琴,陳 貝,王昆秀,張艷琳,羅志輝,顧驍磊,石炎萍,周 婷,許辛寅

(1.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,武漢 430061;2.湖北中醫藥大學第一臨床學院,武漢 430061)

急性心肌梗死是全球冠心病患者發病和死亡的主要原因[1-2]。早期冠狀動脈再灌注是治療急性心肌梗死的經典方法,然而,隨之而來的再灌注損傷發病機制尚未明確,目前對此仍缺乏有效應對措施[3]。心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)伴隨持續的I/R損傷和心肌細胞凋亡,凋亡水平決定了心肌I/R損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)的嚴重程度[4]。前期研究表明“雙固一通”針法固護正氣,能夠提高衰老大鼠抗病能力,對急性心肌梗死細胞具有保護作用,較單純“內關”針刺方法效果更好[5-11]。本研究擬進一步探究“雙固一通”電針預處理在MIRI細胞凋亡中的保護作用及其內在機制。本研究經湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準,編號:SXDX2019050A。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級雄性Wistar大鼠50只,體質量180～220 g,由湖北省醫學科學研究院實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(鄂)2020-0018。大鼠飼養于湖北中醫藥大學標準動物房,環境溫度20～24 ℃,相對濕度40%～45%,每日光照10～12 h,自由進食、飲水。

1.2 主要試劑

肌酸激酶心肌型同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒,貨號分別為 H197-1-1、A020-1-1、A015-1-1,購自南京建成生物科技有限公司;RNA提取液(貨號G3013)、熒光定量PCR試劑盒(貨號G3008),購自武漢賽維爾生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒(貨號K1622),由美國Thermo公司提供;抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(貨號K500),購自丹麥Dako Denmark A/S公司;B淋巴細胞瘤(B-cell lymphoma,Bcl)-2兔多抗(貨號26593-1-AP)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)兔多抗(貨號15422-1-AP),由武漢三鷹生物技術有限公司提供;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-asparate protease,Caspase)-3兔多抗(貨號Ab4051),購自英國Abcam公司;miR-133a-3p抑制劑(5′-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3′),由青島生工生物科技有限公司合成。

A.正常心電圖;B.缺血心電圖;C.再灌注心電圖

1.3 主要儀器

ALC-V8型動物呼吸機,上海奧爾科生物科技有限公司;BL-420S生物機能實驗系統,成都泰盟電子有限公司;Chemray420型全自動生化分析儀,深圳雷杜生命科技有限公司;JB-P5型包埋機,武漢俊杰電子有限公司;RM2016型病理切片機,上海徠卡儀器有限公司;Tecnai G2 20 TWIN型透射電子顯微鏡,美國FEI公司;KZ-Ⅱ型勻漿儀,武漢賽維爾生物科技有限公司;D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機,北京DragonLab公司;Stepone plus型熒光定量PCR儀,美國ABI公司;NanoDrop2000型超微量分光光度計,美國Thermo公司;XSP-C204型普通光學顯微鏡,重慶光電儀器有限公司。

1.4 分組

適應性喂養1周后,將所有動物隨機分為5組:假手術組(sham group,S組)、模型組(ischemia reperfusion group,I/R組)、電針預處理組(electroacupuncture pretreatment group;EA組)、miR-133-3p抑制劑組(antagomir group,Ant組)與電針預處理+miR-133-3p抑制劑組(EA+Ant組)。每組各10只大鼠。

1.5 預處理

分組后對各組大鼠進行預處理。S組:10只大鼠,每天穿自制鼠衣捆綁20 min,共7 d,第8天開胸后暴露心臟,只穿線不結扎。I/R組:10只大鼠,捆綁方法與時間同S組,第8天開胸后行缺血再灌注造模。EA組:對10只大鼠進行電針預處理,穿自制鼠衣,參照華興邦等[12]制定的《大鼠穴位圖譜的研制》取穴,在前肢內側離腕關節約3 mm處的尺橈骨縫間取雙側“內關(PC6)”,用0.30 mm×15 mm毫針針刺雙側穴位,針刺深度約5 mm;在膝關節后外側、腓骨小頭下約5 mm處取雙側“足三里(ST36)”,針刺深度約7 mm;在臍下約25 mm處取“關元(RN4)”,針刺深度約2 mm;接HANS-200電針治療儀,采用連續波,強度為1 mA,頻率2 Hz,每天通電20 min,連續治療7 d,第8天行缺血再灌注術。Ant組:10只大鼠,捆綁方法同I/R組,共7 d,從第5天起連續3 d經尾靜脈注射miR-133-3p抑制劑(80 mg/kg),第8天行缺血再灌注術。EA+Ant組:同時進行電針預處理和miR-133-3p抑制劑預處理,方法同上。

1.6 造模

采用物理結扎法加推管法創建在體MIRI模型[13]。各組大鼠均采用2%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射,麻醉后放置在手術臺上,心電監測,行氣管切開術后插管接呼吸機(潮氣量40,呼吸比1:2,呼吸頻率50次/min)。大鼠左側胸骨第3、4肋間橫消毒后切開皮膚,依次鈍性分離各層組織,暴露心臟。除S組外,各組大鼠均于左心耳下2～3 mm處結扎前降支冠狀動脈造成心肌缺血模型,缺血20 min后再灌注40 min,建立MIRI模型。大鼠缺血過程中缺血標志為左室前壁向外膨脹及心電圖ST段抬高,進行再灌注時再灌注成功標志為左室前壁缺血區紫色消失,抬高的ST段下降1/2。S組大鼠用絲線穿過前降支冠狀動脈但不結扎。造模成功后立刻將各組大鼠麻醉處死取材。

1.7 指標檢測

1.7.1 心電監測 通過BL-420S生物機能實驗系統記錄造模過程中I/R組、EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠的心電圖。

1.7.2 血清生化檢測 取大鼠腹主動脈血5 mL,離心后取上清,采用全自動生化分析儀檢測血清CK-MB、LDH、T-AOC水平。

1.7.3 電鏡 每組3只大鼠,在梗死區域取約1 mm×1 mm×1 mm大小的心肌組織,固定、漂洗、脫水、石蠟嵌入、切片后采用透射電鏡觀察各組大鼠梗死心肌的超微結構。

1.7.4 熒光定量PCR 每組3只大鼠,取心臟前降支冠狀動脈結扎處約100 mg梗死組織,提取總RNA,再反轉錄為cDNA,以cDNA為模板定量擴增目的基因Bax、Caspase-3、Bcl-2、絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKK)3、MKK6、p38MAPK與內參基因GAPDH,用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.7.5 免疫組化 每組取4只大鼠,將其梗死的心肌組織(組織取法參照熒光定量PCR)用4%多聚甲醛固定,切片梯度水化、潤洗后抗原修復,蘇木精染色,脫水,樹脂封片。觀察各組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3及Bcl-2表達。用Image-Pro 6.0圖像分析系統分析陽性產物的積分光密度(integral optical density,IOD)值。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠心電圖

為了驗證模型是否成功,對I/R組、EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠進行心電圖檢測,心電圖對應造模過程不同的階段(圖1)。結果顯示:心肌缺血時可見大鼠ST段抬高,再灌注時ST段下降1/2,說明心肌缺血再灌注模型制造成功。

2.2 各組大鼠血清CK-MB、LDH、T-AOC水平

血清中CK-MB、LDH的含量可直接反映心肌細胞受損程度,T-AOC可反映機體抗氧化能力。與S組比較,I/R組大鼠血清中CK-MB和LDH水平增加,T-AOC水平降低(P<0.05)。與I/R組比較,EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠血清中CK-MB和LDH水平降低,T-AOC水平升高(P<0.05),提示電針可減輕I/R模型大鼠心肌損傷。與EA組比較,Ant組、EA+Ant組大鼠血清中CK-MB水平升高、T-AOC水平降低(P<0.05)。Ant組和EA+Ant組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

注:與S組比較*P<0.05;與I/R組比較#P<0.05;與EA組比較△P<0.05;肌酸激酶同工酶(CK-MB),乳酸脫氫酶(LDH),血清總抗氧化能力(T-AOC);S.假手術組; I/R.模型組; EA.電針預處理組; A.miR-133-3p抑制劑組; EA+Ant.電針預處理+miR-133-3p抑制劑組

62.3 各組大鼠心肌梗死區超微結構

S組大鼠心肌纖維基本正常,肌絲分布均勻、排列整齊,線粒體結構清晰、無水腫。I/R組模型大鼠心肌損傷嚴重,肌纖維排列紊亂,部分肌絲溶解、壞死,線粒體結構紊亂,形狀不規則。EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠心肌纖維排列較整齊,可見清晰肌小節,心肌細胞輕微腫脹,輕度空化,線粒體結構基本完整,小部分線粒體仍存在空泡樣改變,提示電針可減輕I/R模型大鼠心肌損傷。見圖3。

注:黑色箭頭示線粒體;S.假手術組; I/R.模型組; EA.電針預處理組; Ant.miR-133-3p抑制劑組; EA+Ant.電針預處理+miR-133-3p抑制劑組

2.4 各組大鼠心肌梗死區Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達

為進一步探討電針保護MIRI的作用機制,采用熒光定量PCR檢測心肌梗死組織Bax、Caspase-3和Bcl-2 mRNA表達。與S組比較,I/R組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3 mRNA表達水平增加,Bcl-2 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與I/R組比較,EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3 mRNA表達水平降低,Bcl-2 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與EA組比較,Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3 mRNA表達水平增加,Ant組大鼠心肌梗死組織Bcl-2 mRNA表達水平降低(P<0.05),提示EA可能通過降低Bax、Caspase-3表達,升高Bcl-2表達對MIRI起保護作用。Ant組和EA+Ant組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖4。

注:與S組比較*P<0.05;與I/R組比較#P<0.05;與EA組比較△P<0.05,Bcl-2相關X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3); B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)S.假手術組;I/R.模型組;EA.電針預處理組;Ant.miR-133-3p抑制劑組;EA+Ant.電針預處理+miR-133-3p抑制劑組

2.5 各組大鼠心肌梗死區Bax、Caspase-3及Bcl-2陽性表達IOD值

通過免疫組化染色觀察Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達,用IOD值量化陽性產物染色強度,探討電針預處理抗心肌細胞凋亡機制。S組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3表達不明顯,Bcl-2高表達。與S組比較,I/R組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3表達增強,Bcl-2表達減弱(P<0.05)。與I/R組比較,EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3表達減弱,Bcl-2表達增強(P<0.05)。與EA組比較,Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織Bax、Caspase-3表達增強,Bcl-2表達減弱(P<0.05)。Ant組和EA+Ant組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖5。

注:與S組比較*P<0.05;與I/R組比較#P<0.05;與EA組比較△P<0.05; B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相關X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),積分光密度(IOD);S.假手術組;I/R.模型組;EA.電針預處理組;Ant.miR-133-3p抑制劑組;EA+Ant.電針預處理+miR-133-3p抑制劑組

2.6 各組大鼠心肌梗死區MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表達

為了闡明電針對MIRI的作用機制,采用熒光定量PCR檢測各組大鼠心肌梗死區MKK3、MKK6、p38MAPK的mRNA表達水平。與S組比較,I/R組大鼠心肌梗死組織MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表達水平增加(P<0.05)。與I/R組比較,EA組、Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表達水平降低(P<0.05)。與EA組比較,Ant組、EA+Ant組大鼠心肌梗死組織MKK3、MKK6、p38MAPK mRNA表達水平增加(P<0.05),提示EA可能通過抑制MKK3、MKK6、p38MAPK表達保護MIRI模型大鼠。Ant組和EA+Ant組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖6。

注:與S組比較*P<0.05;與I/R組比較#P<0.05;與EA組比較△P<0.05;S.假手術組;I/R.模型組;EA.電針預處理組;Ant.miR-133-3p抑制劑組;EA+Ant.電針預處理+miR-133-3p抑制劑組

3 討論

MIRI的病機包括氣虛、血瘀、痰飲,其中氣虛為本,血瘀痰飲為標,形成惡性循環,故治療時當標本兼顧,可選用“雙固一通”針法[14]?！半p固”取“關元”“足三里”以固先后天之本,振奮一身陽氣,“一通”選“內關”以通經瀉邪[15]。本研究通過心肌I/R大鼠模型驗證了“雙固一通”電針預處理可有效改善MIRI,且具體機制與抑制細胞凋亡相關。

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)在MIRI中發揮重要作用[16],它是I/R后心肌細胞凋亡信號轉導的關鍵因素[17]。p38MAPK是有絲分裂原激活的蛋白激酶的4個特征性亞家族成員之一,可被多種應激刺激激活,激活后的p38MAPK可調控下游多種酶及轉錄因子[18]。先前的研究表明,電針可通過抑制p38MAPK通路減輕I/R過程中的炎癥損傷來改善MIRI[19]。p38MAPK通路的上游激活物是MKK3/4/6,其中MKK3、MKK6僅特異性激活p38MAPK[20]。在本研究中,電針預處理可降低MKK3、MKK6、p38MAPK表達,說明電針預處理可能通過抑制MKK3/6-p38MAPK通路改善MIRI。研究表明,I/R過程中細胞凋亡途徑異常激活[21]。細胞凋亡常伴隨著促凋亡蛋白Bax的增加和抗凋亡蛋白Bcl-2的減少。細胞色素C從線粒體釋放到細胞質是凋亡途徑之一,促使裂解的Caspase-3激活,從而導致細胞凋亡[22]。p38MAPK抑制劑能通過Ras同源基因家族成員(Ras homolog gene family member,Rho)A有效抑制心肌細胞早期凋亡,降低Bax、caspase-3水平,上調Bcl-2[23]。RhoA可調節MKK3、MKK6和p38MAPK的磷酸化水平[24-25]。p38MAPK、RhoA均與凋亡關系密切[26]。p38MAPK相關聯的信號通路都可能與RhoA有直接或間接的聯系[27]。miR-133a-3p是miR-133a的重要組成部分[28],在心肌缺血處理中抑制caspase-3的表達,促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達[29-34]。RhoA是miR-133的潛在調控靶點,上調miR-133水平可調控RhoA表達[35-36]。在本研究中,電針預處理可抑制MKK3、MKK6、p38MAPK表達,下調Bax、Caspase-3表達,上調Bcl-2表達,說明電針預處理可能通過調節MKK3/MKK6-p38MAPK通路改善心肌細胞凋亡。研究結果提示單純抑制劑亦可通過抑制MKK3/MKK6-p38MAPK通路改善心肌細胞凋亡,而電針預處理+抑制劑的干預效果卻低于電針預處理。因此,推測電針預處理能夠通過miR-133a-3p-MKK3/MKK6-p38MAPK通路抑制細胞凋亡,并計劃在以后的研究中進一步探討電針預處理調控miR-133a-3p相關通路的具體機制。

綜上所述,“雙固一通”電針預處理可能通過調節miR-133a-3p-MKK3/MKK6-p38MAPK通路以抑制細胞凋亡,從而改善MIRI。