基于數據挖掘和網絡藥理學探討名老中醫用清熱涼血藥治療銀屑病的組方規律和作用機制?

陳新榮,鄭繼源,陳達滿,莫嘉浩,張振瑜,李焯瑤,高曉露,閆玉紅

(1.廣州中醫藥大學,廣州 510405;2.廣東省中醫院省部共建中醫濕證國家重點實驗室,廣州 510120)

銀屑病是一種臨床常見的經免疫介導的慢性炎癥性皮膚疾病,主要表現為皮膚出現邊界清晰的紅斑、銀白色的銀屑和皮膚表皮增厚[1]。有研究表明,銀屑病在全年齡段中的患病率為0.09%～5.1%,具有病程長、極易復發的特點,給患者的身心帶來了極大負擔[2]。近年來,隨著針對腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白細胞介素(interleukin,IL)-23、IL-17等因子的生物制劑的開發和應用,銀屑病的治療取得了較大進展,但仍然無法根治[3]。

中醫藥防治皮膚病已有多年歷史,具有豐富的臨床實踐經驗。銀屑病屬于中醫學“白疕”“風癬”“松皮癬”等范疇?！吨袊y屑病診療指南(2018完整版)》中提出,該病的發生發展與血分密切相關,“病在血分,從血論治”,血熱、血瘀、血燥是其基本臨床分型[4]。中醫臨床針對血熱型銀屑病進行治療時,也多選用清熱涼血藥物以及涼血和營等治法。名老中醫代表著當前中醫學術和臨床發展的最高水平,他們的辨證用藥經驗對臨床診療具有較大的參考價值。本研究擬通過分析《古今中醫名家皮膚病醫案薈萃》《中醫皮膚病臨證精粹》等若干本中醫著作中名老中醫用清熱涼血藥治療銀屑病的方劑,探討名老中醫用清熱涼血藥治療銀屑病的組方規律,并基于網絡藥理學探討核心藥物的作用機制,以期為臨床治療銀屑病提供處方遣藥的思路和依據。

1 數據挖掘

1.1 數據來源

數據來源于《古今中醫名家皮膚病醫案薈萃》[5]《中醫皮膚病臨證精粹》[6]《中國百年百名中醫臨床家叢書》[7]《國醫大師臨床經驗實錄》[8]《國醫大師驗案良方·皮膚卷》[9]《首批國家級名老中醫效驗秘方精選》[10]《中國現代名中醫醫案精粹》[11]及《徐宜厚皮膚科文集》[12]。

1.2 納入標準

以方劑主治為依據,納入明確主治為“銀屑病”,包括別名“牛皮癬”“白疕”等的方劑;方劑有明確的組成、劑量和用法;依據人民衛生出版社唐德才主編的全國高等中醫藥教材《中藥學》[13]中清熱涼血藥歸類,納入方劑組成中含清熱涼血類中藥的方劑。

1.3 排除標準

中藥外用方劑;方劑組成中含有西藥的方劑;組方重復的方劑。

1.4 中藥藥名規范

參考2020年版《中華人民共和國藥典》[14]《中藥學》[13]以及《中華本草》[15]對中藥名稱進行規范。如“雙花”規范為“金銀花”,“七葉一枝花”規范為“重樓”。

1.5 數據錄入

利用Microsoft Excel 2010軟件進行方劑信息錄入,并采用二分法進行方劑組成處理,如方劑中有該藥物記作“1”,沒有該藥物記作“0”。由2名研究人員進行數據錄入工作,交叉檢查,確保錄入數據準確無誤。

1.6 數據分析

所得方劑數據運用Microsoft Excel 2010計算出中藥用藥頻數,并按降序進行排列;運用SPSS Clementine 12.0軟件所提供的Apriori版塊和R軟件的arules[16]與arulesViz[17]插件進行關聯規則分析,挖掘高頻使用中藥間的配伍關系;運用SPSS 18.0軟件對高頻使用中藥進行聚類分析,提取聚類分析樹狀圖。

2 網絡藥理學

根據數據挖掘結果,獲得了生地黃、牡丹皮、赤芍和紫草4味核心藥物。為了進一步探討這4味清熱涼血藥治療銀屑病的作用機制,基于網絡藥理學進行分析。

2.1 成分-靶點網絡

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP[18](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)是一個專門收集并分析中藥成分的系統藥理數據庫,其中藥大部分來自中國藥典,數據類型包含各種中藥成分及其作用靶點,數據全面且可靠。在TCMSP中檢索紫草、赤芍和牡丹皮,并獲取它們的活性成分?；钚猿煞职凑湛诜锢枚?oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL) ≥0.18進行篩選。由于生地黃未被TCMSP收錄,因此本研究通過文獻檢索獲取了生地黃的活性成分[19-26]。將中藥活性成分導入至SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/index.php)進行毒藥物動力學參數(absorption,distribution,metabolism,and excretion,ADME)篩選。篩選標準:“GI absorption”為“HIGH”;“Druglikeness”單元任意2項為“YES”。獲得4味中藥的活性成分后,將其導入至SWisstargetprediction中預測藥物靶點,選擇P值>1的靶點,并在UniProt數據庫中進行基因名稱的標準化。

2.2 銀屑病疾病靶點搜集

分別在GeneCard、TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM等疾病靶點數據庫中,以“psoriasis”作為檢索詞搜索銀屑病的相關疾病基因,篩選種族為人類。將搜集到的疾病靶點匯總去重后,在Uniprot數據庫中進行基因名稱的標準化與補充。

2.3 核心靶點篩選

利用Cytoscape3.8.2中的BisoGent插件分別對藥物成分靶點和疾病靶點進行蛋白互作網絡預測,并取2個網絡的交集。利用CytoNCA插件對交集網絡進行拓撲學分析,根據結果中的“Degree”值制定篩選條件,提取核心靶點。

統計活性化合物與核心靶點相互作用的頻數,篩選出與核心靶點相互作用最多的化合物作為核心化合物。

2.4 GO和KEGG富集分析

將“2.3”方法篩選所得核心靶點導入David數據庫中進行基因功能注釋(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,并利用R軟件進行可視化。

3 結果

3.1 數據挖掘結果

3.1.1 納入方劑結果 依據納入標準和排除標準,最終篩選出181個治療銀屑病的方劑。

3.1.2 藥物頻次統計結果 181個治療銀屑病方劑中共涉及215味中藥。對所有中藥進行頻次統計并進行降序排列,頻次≥17的高頻中藥有35種,其中使用頻次最高的中藥是清熱涼血藥生地黃,使用頻次為112次,其次為牡丹皮、赤芍、紫草,見表1。

表1 銀屑病方劑的中藥頻次統計表

3.1.3 關聯規則分析 采用SPSS Clementine 12.0軟件的Apriori版塊進行建模,將支持度設置為20%,置信度設置為0.70,最大前項數由1逐增到5,直到不出現新的關聯規則。得到藥對關聯規則11條,見表2,3味中藥藥組關聯規則14條,見表3,4味中藥藥組關聯規則3條,見表4。所有藥組關聯規則提升度均>1,表明各個關聯規則前后項之間存在關聯性。

表2 銀屑病方劑的藥對關聯規則分析表

表3 銀屑病方劑的3味中藥藥組關聯規則分析表

表4 銀屑病方劑的4味、5味中藥藥組關聯規則分析表

為進一步展現藥物間相互關系,使用R軟件的arules和arules Viz插件進行關聯規則分析,設置sup=0.06,conf=0.7,并導出點狀網絡圖,見圖1。

圖1 銀屑病方劑的藥物間相互關系網絡圖

3.2 網絡藥理學結果

3.2.1 構建成分-靶點網絡 匯總去重后共獲得62個有效成分,見表5。匯總去重后共獲得作用靶點697個。將數據導入 Cytoscape 3.8.2中構建“成分-靶點”網絡圖,結果顯示共有節點321個,1195條成分與靶點相互作用連線,見圖2。

圖2 銀屑病方劑核心中藥的成分和靶點關系網絡圖

表5 銀屑病方劑核心中藥的活性成分表

3.2.2 核心靶點篩選結果

經檢索匯總共獲得2855個疾病靶點,與藥物作用靶點進行交集映射后,利用CytoNCA插件對交集網絡進行拓撲學分析,將結果中的“Degree”值作為篩選條件,篩選“Degree”值大于等于2倍中位數的靶點,即Degree ≥ 48,共獲得2579個靶點。之后根據“Betweenness”“Degree”和“Clossness”這3個指標進行分析,篩選大于等于中位數的靶點,最終得到376個核心靶點,見圖3。

圖3 銀屑病方劑核心中藥的核心靶點篩選流程圖

統計分析活性化合物與核心靶點相互作用情況,篩選出相關性最大的10個核心化合物,見表6。

表6 銀屑病方劑核心中藥的核心化合物及其作用頻數統計表

3.2.3 GO和KEGG富集分析結果

富集后共獲得2112條GO條目,其中包含生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular components,CC)和分子功能(molecular functions,MF),篩選出P<0.05的條目。GO富集分析中藥作用于銀屑病的生物學過程主要集中在mRNA轉錄翻譯和蛋白質合成的相關功能中,如:信使核糖核酸分解過程(mRNA catabolic process)、靶向膜的共翻譯蛋白(cotranslational protein targeting to membrane)和核轉錄mRNA分解代謝過程(nuclear-transcribed mRNA catabolic process)等,見圖4-6。

圖4 銀屑病方劑核心靶點的生物學過程顯著性氣泡圖

圖5 銀屑病方劑核心靶點的細胞組分顯著性氣泡圖

圖6 銀屑病方劑核心靶點的分子功能顯著性氣泡圖

同樣將核心靶點進行KEGG通路富集分析,篩選出P<0.05的通路。從結果可以發現,其通路機制多與炎癥、免疫相關,如:神經營養因子信號通路、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)信號通路和缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1信號通路等,見圖7。

圖7 銀屑病方劑核心靶點的KEGG富集結果

4 討論

中醫認識銀屑病的歷史源遠流長,早在《五十二病方》中就有關于銀屑病相關癥狀的記載,此后歷代醫家皆有論述。近代醫家對銀屑病的病因病機也有深入探討,國醫大師禤國維認為本病由營血虧損,化燥生風,肌膚失養引起,發病常因內外合邪共同作用所致,他認為治療銀屑病的關鍵是“從血論治”;朱仁康教授認為銀屑病由“血分有熱、血熱風燥”所致,血熱為內在病因,加之外邪或七情內傷或飲食不節等因素影響,導致血熱內蘊,熱盛生風,內不得泄,外不得發,毒邪外壅,發為銀屑病[27]?？梢?在銀屑病的發病過程中,血熱是一個不可忽視的因素,“清熱涼血”之法在銀屑病的治療中發揮了重要的作用。

從中藥頻次分析結果可以發現,使用頻次較高的中藥為生地黃、牡丹皮、赤芍、紫草,使用頻次均在70次以上。本研究旨在探究清熱涼血藥物在治療銀屑病方劑中的使用情況,但高頻中藥中還有金銀花、白花蛇舌草為代表的清熱解毒藥,以及丹參、雞血藤為代表的活血調經藥,故認為在治療血熱型銀屑病時,多以清熱涼血為主,同時也需配以活血化瘀、養血解毒,體現中醫“從血論治”銀屑病的中心思想,切合其“血分蘊毒”的病機。蟲類藥善于走竄,有搜經通絡、破血逐瘀的功效。由于銀屑病臨床常見病程長,久病難愈,并伴有瘙癢發熱以及局部皮膚肥厚等癥狀,為血熱蘊毒,深遏肌膚,難以外散的表現,因此,在治療銀屑病時配伍蟲類藥物蟬蛻和僵蠶,可以搜經通絡,祛風止癢,破血逐瘀。淡滲利濕藥薏苡仁和茯苓有健脾益氣,和胃滲濕的功效,補益類藥物甘草、黃芪出現頻次也較高,故認為治療銀屑病除治風、治血之外,還應根據臨床需要配伍使用祛濕、補氣的藥物,契合中醫祛邪不忘扶正的治療思路。同時,黃芪也為皮膚病治療的常用藥物,有益氣固表,斂汗固脫,脫瘡生肌,利水消腫,祛瘀排膿的作用?！侗静輩R言》中記載“黃芪可以榮筋骨;癰瘍之證,膿血內潰,陽氣虛而不斂者,黃芪可以生肌肉;又陰瘡不能起發,陽氣虛而不潰者,黃芪可以托膿毒”[28]?，F代藥理學研究表明,黃芪有抗自由基損傷,抑制細胞凋亡,增強細胞抵抗力,修復機體,促進體液免疫和細胞免疫等作用[29-30]。李炎夏等[31]使用黃芪聯合維胺酯治療銀屑病,發現黃芪能有效促進上皮細胞分化與生長,抑制角化過程,可以明顯改善微循環,療效顯著。

藥對關聯規則中牡丹皮→生地黃、生地黃→牡丹皮為支持度最高的藥組,它們也常以藥對形式出現在治療皮膚病的常用方和經驗方中。同時兩藥也常與赤芍、紫草、水牛角、玄參等清熱涼血藥相配伍。紫草味甘、咸,性寒,有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的作用,現代藥理學研究發現紫草在自身免疫性疾病的治療上具有重要價值,是一種高選擇性抗炎藥物[32]。玄參和水牛角均可涼血解毒、解毒散結,可用于血熱毒盛、發斑發疹,與牡丹皮、生地黃相須為用,解毒涼血之力更強。關聯規則分析網絡圖可進一步印證藥物間相互作用關系。生地黃、牡丹皮居于網絡中央,緊密相連,外周相關性較強的藥物有水牛角、玄參、紫草、土茯苓、赤芍、甘草等。三四味藥組關聯規則與藥對關聯規則用藥大體相同,進一步揭示了中藥之間的組成規律。藥對關聯規則中金銀花→連翹配伍的提升度最高,金銀花味甘、性寒,功效為清熱解毒、疏散風熱;連翹味苦、性微寒,功效清熱解毒、消腫散結、疏散風熱,兩藥相配可進一步增強清熱解毒、疏散風熱的作用,是治療風熱之邪的常用藥對,代表方劑為銀翹散?，F代研究表明金銀花和連翹配伍使用具有抗病毒、抗菌、解熱抗炎的藥理作用[33]。

通過頻次統計、關聯規則分析發現,生地黃、牡丹皮、赤芍、紫草為高頻藥物組合,在銀屑病的治療中發揮重要作用,因此可確定它們為核心藥物。從TCMSP數據庫和文獻閱讀中獲得了62個有效活性成分,其中異戊酰紫草素、乙酰紫草根素、黃芩素、木犀草素、山柰酚等在成分-靶點網絡中與最多的核心靶點相互聯系,說明其可能為治療銀屑病的關鍵活性成分。研究表明,黃芩素有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種功效,可通過抑制細胞周期蛋白復合物調節細胞周期,以清除氧化自由基,誘導細胞凋亡,抑制腫瘤浸潤[34];此外還有研究發現,黃芩素可通過抑制Notch1基因延緩皮膚鱗癌細胞的增殖及侵襲進程[35]。實驗研究證明木犀草素通過抑制核因子(nuclear factor,NF)-κB的表達和激活來抑制巨噬細胞、T細胞和中性粒細胞的皮膚浸潤,可以下調銀屑病小鼠炎癥介質的表達,從而改善銀屑病樣皮損[36]。山柰酚也具有強大的抗炎、抗氧化和抗癌特性。實驗證明山柰酚可以降低銀屑病皮損中CD3+T細胞浸潤和主要促炎細胞因子的基因表達,還可在體外抑制T細胞的增殖及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號傳導[37]。目前也有多篇文獻支持異戊酰紫草素、乙酰紫草根素具有抗腫瘤作用,可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖、分裂并促進其凋亡[38-40]。

篩選得出的376個核心靶點主要涉及炎癥反應、免疫反應、血管損傷修復等功能,在涼血解毒藥物治療銀屑病中發揮重要作用。對相關靶點進行富集分析,GO富集分析顯示中藥作用于銀屑病的生物學過程主要集中在mRNA轉錄翻譯和蛋白質合成的相關功能方面,如:信使核糖核酸分解過程、靶向膜的共翻譯蛋白和核轉錄mRNA分解代謝過程。KEGG通路富集分析顯示涼血解毒中藥主要通過神經營養因子信號通路、PI3K-Akt信號通路和HIF-1信號通路等發揮作用。神經營養因子作為結構性皮膚細胞的生長因子,在銀屑病患者中高表達,可調節皮膚的免疫功能,使角質形成細胞過度增殖,導致表皮細胞的動態平衡被破壞,表皮厚度增加[41]。有研究表明,PI3K-AKT信號通路參與銀屑病角質形成細胞的過度增殖和異常分化,促進微血管生成,并且會導致血脂異常,還會抑制細胞自噬功能并促進角質形成細胞中炎性細胞因子的產生和細胞增殖[42]。HIF-1α是HIF-1信號通路的關鍵轉錄因子,HIF-1α的表達增加可促使血管生成介質如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、IL-8和血管生成素在銀屑病皮膚中的表達也增加,促進角質形成細胞的血管生成。HIF-1α還與輔助性T 細胞(T helper cell,Th)17分化相關,Th17細胞增加能夠誘導角質形成細胞中IL-8表達升高,從而影響銀屑病的預后[43-44]。

綜上所述,本研究應用數據挖掘技術,從若干本中醫著作中挖掘名老中醫用清熱涼血藥治療銀屑病的方劑,探討名老中醫用清熱涼血藥治療銀屑病的組方規律,對隱性藥物使用和配伍關系進行顯性總結,研究得出“從血論治”是治療銀屑病的中心思想。本研究挖掘出名老中醫用藥經驗中的核心藥物為生地黃、牡丹皮、赤芍、紫草,治療時以清熱涼血藥為主,同時輔以活血化瘀、養血解毒、祛風止癢、破血祛瘀之法,并且祛邪不忘扶正。并運用網絡藥理學技術對核心藥物的作用機制進行預測,認為異戊酰紫草素、乙酰紫草根素、黃芩素、木犀草素、山柰酚等活性成分通過作用于神經營養因子信號通路、PI3K-Akt信號通路和HIF-1信號通路等發揮抗炎、調節免疫反應、調控轉錄水平、血管損傷修復等作用。本研究基于藥物和疾病數據庫獲取藥物有效成分和靶點信息,預測結果對數據庫具有依賴性。此外,部分靶點和有效成分的支持證據尚不充分,因此仍需進一步實驗來驗證其具體作用機制。