血清miR-143、miR-21 對乙型肝炎病毒相關性肝纖維化的早期診斷價值

張小博 趙華山 馬鵬飛

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）造成的肝臟疾病，其主要病理基礎是肝纖維化，隨著病情的發展可進展為肝硬化甚至肝癌，具有較高的致死率，對家庭及醫療系統均造成了一定的負擔[1]。在肝纖維化發生初期，及時采取有效的治療措施能一定程度逆轉肝纖維化，因此在乙型肝炎患者抗病毒治療的過程中，明確早期肝纖維化的影響因素，并及早做出有效診斷以采取干預措施逆轉肝纖維化的發展，對于改善預后有重要意義[2]。目前臨床診斷肝纖維化的“金標準”是肝組織活檢，該方式屬于有創操作，難以廣泛開展，而常用的透明質酸、四型膠原、Ⅲ型前膠原肽、層黏連蛋白等血液肝纖維化指標對早期肝纖維化診斷的特異性較差[3，4]。故尋求更為有效地反映肝纖維化早期的無創指標具有重要意義。miRNAs 作為廣泛存在于動植物體內的非編碼單鏈RNA 分子，在細胞增殖、凋亡、脂肪代謝等方面發揮一系列的調控作用，成為近年來各種臨床疾病診療、發病機制、預后預測的研究熱點。國內外學者通過實時熒光定量PCR、高通量芯片等技術發現多種miRNAs 在人與動物的各種疾病中差異表達，其中miR-143、miR-21 被證實在HBV 相關性肝病中異常表達[5，6]。但關于二者對肝纖維化早期診斷價值的相關研究較少。故本研究以2019 年6 月～2020 年6 月收治的89 例CHB 患者為研究對象，分析血清miR-143、miR-21 對HBV 相關性肝纖維化的早期診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2019 年6 月～2020 年6 月在我院就診的CHB 患者89 例作為疾病組。納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 年更新版）》[7]診斷標準，且經皮肝組織活檢確定肝纖維化分期≤S1 期；②入院前6 個月內未接受相關治療；③年齡≥18 歲。排除標準：①排除存在非HBV 造成的其他肝病毒感染者；②存在肝癌、酒精性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等其他肝臟炎癥者；③伴有肝血管瘤、血吸蟲肝病者。另選取年齡、性別相匹配的健康體檢者90 例作為對照組。疾病組中男50 例，女39 例，年齡19～65 歲，平均（35.52±10.23）歲；對照組中男47 例，女43 例，年齡18～65 歲，平均（35.60±12.12）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究開展前受試者均知情同意且簽署知情同意書，研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》倫理道德標準。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-143、miR-21 檢測收集患者檢驗室剩余血液，分離血清后以RNA 提取試劑盒提取RNA，經逆轉錄試劑盒獲得cDNA，按照試劑盒說明書設定反應體系（試劑盒均購于廣州賽百純生物科技有限公司），反應條件：95℃預變性3min，95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸28s，重復35 個循環，72℃延伸5min，以U6 為內參，2-△△Ct為目的基因的相對表達量，引物序列miR-143：5'-TAGCTATCGATGACGATACGCGCT-3'（F），5'-G TGTATATCAGCGTAACGATCCA-3'（R）；miR-21：5'-ACTCTACTGTATAAGCTCTGA-3'（F），5'-CAGC TATGCATCTACTACGGC-3'（R）；U6：5'-TCCCATC GATTACGTAGCCGAGCT-3'（F），5'-GGCAATCAGA ATACCTGTGTATC-3'（R）。

1.2.2 其他血清生化指標檢測 收集患者檢驗室剩余血液4mL，以BC-5000 全自動血液細胞分析儀（邁瑞生物醫療電子股份有限公司）檢測天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、白蛋白（Albumin，ALB）、總膽紅素（Total bilirubin，TBil）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glu-tamyltranspeptidase，γ-GT）、凝血酶原時間（Prothrombin time，PT）、白細胞（White blood cells，WBC）、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板（Platelet，PLT）；熒光定量PCR 檢測HBV-DNA復制水平，雅培i2000SR 化學發光免疫分析儀及配套試劑檢測乙肝五項[乙肝表面抗原（Hepatitis B

surface antigen，HBsAg）、乙肝表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝e 抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e 抗體（Hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝核心抗體（Hepatitis B core antibody，HBcAb）]，相關儀器試劑購于美國雅培有限公司（中國）。

1.2.3 肝組織病理學檢查 疾病組患者實施肝組織病理學檢查，在B 超引導下進行肝臟穿刺獲取肝組織標本，至少獲得6 個匯管區標本，常規石蠟包埋，由2 名工作經驗5 年以上病理科醫師對肝臟標本組織進行診斷，按照國際Scheuer 系統標準[8]，肝纖維化程度分為S0 期：無纖維化；S1 期：匯管區纖維化擴大；S2 期：匯管區周圍纖維化/纖維間隔形成；S3 期：纖維化伴小葉結構紊亂；S4 期：肝硬化。其中S1 期為肝纖維化早期。

1.2.4 觀察指標 包括性別、年齡、飲酒史、吸煙史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、血清生化指標等。

1.3 統計學分析采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，數據比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布數據以四分位數間距[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，組內兩兩比較采用Z檢驗；多因素Logistic 回歸分析影響早期HBV 相關性肝纖維化的危險因素；建立受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線，分析血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關性肝纖維化的診斷價值，計算ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC）。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝功能指標比較與對照組比較，疾病組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平更高，差異具有統計學意義（P<0.05）；兩組PT、ALB 水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組肝功能指標比較（）

表1 兩組肝功能指標比較（）

2.2 兩組血清miR-143、miR-21 水平比較與對照組比較，疾病組S0 期、S1 期miR-143、miR-21 相對表達量更高，差異有統計學意義（P<0.001）；與S0期比較，S1 期miR-143、miR-21 相對表達量更高，差異有統計學意義（P<0.001）。見圖1。

圖1 血清miR-143、miR-21 表達水平箱型圖

2.3 疾病組早期肝纖維化與無肝纖維化患者血清miR-143、miR-21 表達水平及其他因素差異疾病組病理結果顯示42 例S1 期（早期纖維化），47 例S0 期（無纖維化）。早期肝纖維化患者AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL 占比均高于無纖維化患者，ALB 水平低于無纖維化患者（P<0.05）；兩組性別、年齡、飲酒史、吸煙史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、ALT、TBil、γ-GT、PT、Hb、WBC、PLT 水平及HBeAg、HBeAb、HBcAb 陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組血清miR-143、miR-21 表達水平及其他因素比較

2.4 影響早期HBV 相關性肝纖維化發生的多因素Logistic 回歸分析將單因素分析有統計學差異的自變量納入多因素Logistic 回歸分析，采用向前似然比法，引入變量標準α入=0.05，剔除標準α出=0.10，以CHB 患者是否存在早期肝纖維化（無纖維化=0，有早期纖維化=1）為因變量，進入Logistic回歸分析模型，結果顯示：miR-21、miR-143、HBVDNA 病毒載量>1×107copy/mL、ALP 是影響早期HBV 相關性肝纖維化的危險因素（P<0.05）。見表3。

表3 影響HBV 相關性肝纖維化早期發生的多因素Logistic 回歸分析

2.5 血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關性肝纖維化的診斷價值ROC 曲線顯示：血清miR-143 聯合miR-21 診斷早期HBV 相關性肝纖維化的靈敏度、約登指數、AUC 均大于血清miR-143 與miR-21 單獨診斷。見表4、圖3。

圖3 血清miR-143、miR-21 診斷早期HBV 相關性肝纖維化的ROC 曲線

表4 血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關性肝纖維化的診斷效能

3 討論

CHB 是我國常見肝臟傳染性疾病，目前尚無有效根治措施。資料顯示[9]，我國2005～2016 年全國CHB 報告發病率從27.01/10 萬上升至60.08/10 萬，且≥20 歲人群CHB 報告發病率上升趨勢更為明顯，對居民健康造成了嚴重威脅。當機體感染HBV后，進入慢性乙肝期，肝臟的自我損傷修復導致肝纖維化，隨著纖維化的持續發展，肝臟修復過程失調，逐漸轉化為肝硬化及肝癌，進而危及患者生命[10]。在肝臟纖維化發展的過程中，去除影響肝臟損傷的相關因素，并進行有效地保肝治療可延緩纖維化進展甚至逆轉這一過程，降低肝硬化及肝癌等嚴重肝臟病變風險[11]。因此，在肝纖維化早期明確肝纖維化進程的影響因素并及時進行有效的診斷，監測病情進展，以采取針對性的治療方案是改善預后的關鍵。

近年來miRNAs 的表達差異逐漸成為各種疾病的相關研究熱點，并成為早期診斷及病情監測的有效預警性標志。miRNAs 能特異性地與靶mRNA 的3'端非翻譯區結合，調控相關基因的表達，參與胚胎的發育、感染與防御，細胞的增殖、凋亡、脂肪的代謝等生命活動[12]。miR-143 與miR-21 是miRNAs 成員，均參與肝臟疾病的發生發展。Zhang 等[13]采用TaqMan 低密度陣列和實時定量PCR 技術，在HBV 肝硬化、正常肝臟和肝細胞癌組織中篩選了差異表達的miRNA，認為miR-143 可用于HBV 早期診斷、肝硬化及總生存期預測。朱錦宏等[14]研究發現，miR-143 在HBV 相關肝病患者中有異常表達，其在健康對照者、慢性乙肝、乙肝肝硬化、乙肝肝癌患者中的表達量逐漸升高，提示miR-143 與乙肝相關肝病患者病情進展有關。另有研究[15]發現，miR-143 啟動子中rs4705342 多態性可通過改變HBV 誘導的核因子κB 信號通路相關蛋白表達，從而引起HBV 感染，并促進乙肝相關性肝癌的發生。Dundar 等[16]發現miR-21 的過表達與HBV 介導的肝細胞癌肝移植患者復發有關。Jiang 等[17]認為miR-21 水平與肝臟代償失調的程度密切相關，可用于評估肝硬化嚴重程度。本研究結果中，疾病組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平及miR-143 與miR-21 相對表達量均高于對照組，證實miR-143、miR-21 在CHB 患者中異常表達。

本研究通過單因素分析發現疾病組發生早期肝纖維化患者的AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL 占比均高于無纖維化患者，ALB 水平低于無纖維化患者。進一步行多因素Logistic 回歸分析顯示miR-21、miR-143、HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL、ALP 是影響早期HBV 相關性肝纖維化的危險因素，說明miR-21、miR-143 的異常表達可增加早期HBV 相關性肝纖維化的發生風險。HBV 相關性肝纖維化的病理變化表現為HBV 感染后在肝臟進行大量的復制，刺激機體免疫系統的病毒清除機制，引發免疫炎性損傷，導致肝細胞的損害，隨之肝臟組織進行自我修復，這一過程導致肝臟內纖維結締組織異常增生，進而發生肝纖維化[18]。而miR-143、miR-21 均可通過調控相關信號通路，參與肝纖維化的發展，因此其表達水平的異?？蓪е孪嚓P信號通路調控失衡，促進肝纖維化的發生。此外本研究中ROC曲線分析結果顯示，miR-143 與miR-21 聯合診斷早期HBV 相關性肝纖維化的靈敏度、約登指數與AUC 均大于單獨診斷，提示miR-143 聯合miR-21 對早期HBV 相關性肝纖維化的診斷效能較好。miRNAs 在血液中的穩定性較好，具有重復性和特異性高的特點，可考慮將miR-143 與miR-21 作為監測早期HBV 相關性肝纖維化發生的生物學標志物。

綜上所述，血清miR-143、miR-21 在CHB 患者中異常表達，且二者均是影響早期HBV 相關性肝纖維化發生的相關因素，對早期HBV 相關性肝纖維化有較高的診斷價值，可考慮作為診斷早期HBV 相關性肝纖維化的生物學標志物。