川芎-丹參藥對主要藥理成分的網絡藥理學和指紋圖譜研究

劉明月, 楊玉梅, 鄭延澤

(1. 內蒙古自治區錫林郭勒盟安神醫院, 內蒙古 錫林浩特, 026000;2. 內蒙古自治區錫林郭勒盟中心醫院, 內蒙古 錫林浩特, 026000)

丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩和涼血消癰功效,其主要活性成分為丹參酮、丹參酚酸類化合物和揮發油等[1]。川芎活血行氣,其主要活性成分包括阿魏酸、綠原酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、迷迭香酸、洋川芎內酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內酯等。川芎-丹參藥對可活血行氣,其中丹參活血而不傷血,川芎辛溫香燥,走而不守,上行頭目,下入血海,兩者配伍可使活血化瘀、行氣止痛之功倍增,為典型的相須配伍[2]。目前,參芎葡萄糖注射液、冠心寧注射液、冠心寧片等多種川芎-丹參配伍制劑已被用于臨床疾病的治療中。孫青[3]利用高效液相色譜法(HPLC)檢測川芎-丹參藥對不同配比的有效成分含量,發現合煎液中各成分提取率顯著高于單煎液提取率。張聰等[4]利用中藥方劑數據庫計算川芎與其他中藥配伍出現的頻率,其中川芎-丹參藥對居第1位。相關研究[5]表明,川芎-丹參配伍可治療心肌梗死、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病。近年來,基于網絡藥理學探討中藥復方作用機制的研究眾多,中藥復方的多層次多靶點網絡可闡釋藥物的治病機理。本研究基于網絡藥理學研究方法分析川芎-丹參藥對的活性成分、靶點和對疾病的作用機制,以期為臨床合理使用川芎-丹參藥對提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 成分和靶點的收集與篩選

在中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)數據庫(https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中搜索川芎和丹參的活性成分和作用靶點。藥物經肝臟進入體循環血液中的藥量占口服劑量的百分比稱為口服生物利用度(OB), 是中藥制劑研發過程中的關鍵藥動學指標。類藥性(DL)指活性成分與已知藥物的相似性,是篩選藥用成分的關鍵參數。通常OB值越高,活性成分的藥用價值越高。中藥藥用成分篩選條件為OB≥30%, DL≥0.18[6-7]。

1.2 疾病數據收集和靶點對應基因獲取

依照“1.1”方法篩選靶點,檢索TCMSP數據庫中與其對應的疾病,通過Uniprot網站(https://www.uniprot.org/)的UniprotKB數據庫獲取靶點相應基因,以Excel格式導出,使用VLOOKUP函數將靶點與基因信息一一對應[8]。

1.3 多層次多靶點網絡的構建

使用Cytoscape 3.9.1軟件將已收集的川芎和丹參的活性成分、靶點和疾病整合后,構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡[9]。構建的網絡中,點和線的顏色、粗細均可賦值表示相應指標,如圓圈的大小和顏色表示藥物-成分-靶點-疾病的連通性和權重高低。Degree表示某一節點與其他節點連接邊的數量。Cytoscape網絡分析常以Degree值高作為篩選參數,川芎-丹參藥對的網絡構建亦參考此方法,即篩選Degree值高的關鍵參數,構建川芎-丹參“藥物-成分-靶點-疾病”網絡,并探討川芎-丹參藥對的作用機制。

1.4 基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用GO基因功能注釋分析和KEGG通路富集分析方法分析川芎-丹參藥對的作用機制。在DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中導入整理好的靶點基因,選擇與靶點基因名稱對應的選項,點擊"Homo Sapiens", 提交基因列表。數據處理后,導出生物過程、分子功能、細胞成分和KEGG通路數據,設定閾值P<0.05, 繪圖[10-12]。

1.5 川芎-丹參藥對指紋圖譜研究

1.5.1 溶液制備: 取15批藥材(每批藥材為丹參、川芎各5 g), 分別置于錐形瓶中,加100 mL水浸泡 1 h后,回流提取2.5 h, 抽濾后得丹參-川芎合煎液,加入70%乙醇稀釋后得到供試品溶液。

1.5.2 混合對照品溶液制備: 取谷甾醇、川芎嗪、丹參醇B、鼠尾草酚酮、木犀草素、川芎哚對照品,加70%乙醇制成混合對照品溶液。

1.5.3 色譜條件: 使用Agilent XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動相為乙腈(A)-水(B), 梯度洗脫(0～35 min、17%～28% A, 35～50 min、28%～75% A, 50～60 min、75%～80% A), 流速1.0 mL/min, 檢測波長280 nm, 柱溫20 ℃, 進樣量20 μL。

2 結 果

2.1 川芎-丹參藥對的活性成分篩選

搜索TCMSP數據庫發現川芎-丹參藥對的活性成分324個(川芎175個,丹參149個),根據條件(OB≥30%, DL≥0.18)篩選后共得到15個主要活性成分,見表1。

表1 川芎-丹參藥對中15個活性成分信息

2.2 多層次多靶點網絡的構建與分析

川芎-丹參藥對的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖含有259個節點(2種藥物, 15個成分, 72個靶點,187種疾病)和453條邊線。以Degree≥10為條件篩選關鍵活性成分和靶點,以Degree≥5為條件篩選疾病。篩選結果顯示, Degree≥10的活性成分有谷甾醇(編號CX-1)、丹參醇B(編號DS-2)、川芎嗪(編號CX-8)、木犀草素(編號DS-7)、鼠尾草酚酮(編號DS-5), 其Degree值分別為43、36、32、29、22, 說明這5個活性成分是構建網絡中關鍵活性成分,在川芎-丹參藥對的藥理作用中具有功效; Degree≥10的靶標蛋白有10個,包括醛糖還原酶(AKR1B1)、碳酸酐酶2(CA2)、碳酸酐酶1(CA1)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、去甲腎上腺素轉運體(SLC6A2)和腺苷受體A1(ADORA1),以上靶標蛋白中Degree最高的為AKR1B1,表明川芎-丹參藥對可以調節其表達,對機體產生作用; Degree≥5的疾病有8種,包括疼痛、心血管疾病、阿爾茨海默病、前列腺癌、腦損傷、炎癥、焦慮癥、精神分裂癥,其中Degree最高的為心血管疾病,這與川芎-丹參藥對主要治療心血管疾病相吻合。見表2。

表2 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡節點及參數

2.3 GO富集分析結果

利用DAVID 6.8數據庫,以P<0.05且人類物種為條件進行GO功能富集分析。GO富集分析共得到條目223條: 生物過程165條,包括對藥物的反應、增殖過程的正調控、轉錄的正調控和DNA模板化、Erk1和Erk2級聯的正調控、缺氧反應等; 分子功能30條,包括序列特異性DNA結合、轉錄調節區DNA結合、藥物結合、蛋白酶結合和細胞因子活性等; 細胞組成28條,包括質膜、含膠原的細胞外基質、質膜組成部分、膜區、細胞表面等。GO富集分析的主要結果見圖1、表3。

A: 生物過程; B: 分子功能; C: 細胞組成。

表3 川芎-當歸藥對相應基因GO富集分析結果(各類型前5條條目)

2.4 KEGG通路富集分析結果

利用DAVID 6.8數據庫進行KEGG通路富集分析,共得到78條信號通路,包括癌癥通路、神經活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、乙肝信號通路、癌癥中的蛋白多糖等。KEGG通路富集分析的主要結果見圖2、表4。

圖2 KEGG富集結果(前20條通路)

表4 川芎-當歸藥對相應基因KEGG富集分析結果(前16條通路)

2.5 川芎-丹參藥對指紋圖譜的建立

分別取15批川芎-丹參飲片(S1～S15), 制備供試品溶液并分別進樣,記錄色譜圖,導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)中,設置時間窗寬度為0.3, 采用中位數法,進行色譜峰匹配,生成對照圖譜,共標定11個共有峰,得到川芎-丹參藥對指紋圖譜,見圖3。與混合對照品溶液色譜圖相比,色譜圖標定谷甾醇、川芎嗪、丹參醇B、鼠尾草酚酮、木犀草素、川芎哚這6個色譜峰,見圖4。15批川芎-丹參藥對指紋圖譜相似度分別為0.999、0.998、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999、0.998、0.999、1.000、0.999、1.000、0.997、0.999、1.000,提示15批飲片均質量穩定。

圖3 15批川芎-丹參樣品的HPLC指紋圖譜

圖4 混合對照品溶液的色譜圖

3 討 論

本研究基于網絡藥理學研究方法,通過TCMSP和DAVID 6.8數據庫分析川芎-丹參藥對的活性成分、靶標蛋白和疾病,并對靶點基因進行GO和KEGG富集分析,發現川芎-丹參藥對有72個靶點, 2種藥物的15種活性成分參與調節靶標基因的生物學過程、細胞功能和分子組成,從而達到治療相關疾病的藥理作用。

“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖中,川芎和丹參中Degree值排名前2位的活性成分分別為谷甾醇和丹參醇B, HPLC指紋圖譜檢測表明谷甾醇和丹參醇B為川芎和丹參中的活性成分。裴浩等[13]發現,谷甾醇可以抑制口腔鱗狀細胞癌增殖。陳穎[14]通過微量稀釋法發現丹參醇B具有抗菌抑菌作用,與頭孢噻肟聯用抑菌效果可提高6倍。本研究發現,靶標蛋白AKR1B1、CA2、CA1、ALDH2、PTGS1、EGFR、MMP9、MMP2、SLC6A2和ADORA1的Degree值高于10, 說明以上靶標蛋白作為關鍵靶點參與調控疾病信號通路。疼痛等疾病的靶點AKR1B1、CA2與細胞凋亡和心肌纖維化等信號轉錄因子相關度較高,說明這2個靶標蛋白參與川芎-丹參治療疾病的免疫反應過程。王倩婷等[15]研究了AKR1B1對乳腺癌患者MCF-7細胞的調節機制,發現AKR1B1能有效抑制細胞凋亡現象。

GO富集分析和KEGG富集分析結果表明,大部分靶標蛋白富集在增殖過程的正調控、Erk1和Erk2級聯的正調控生物學過程, Erk1和Erk2為細胞外信號調節激酶的成員,參與調控細胞分化和細胞凋亡過程,可促進細胞增殖,在多種腫瘤中異常表達[16-17],推測抗癌可能是川芎-丹參藥對的重要藥理作用之一。

綜上所述,川芎-丹參藥對治療疼痛、炎癥、癌癥等多種疾病與AKR1B1、CA2、CA1、ALDH2等靶點有關,也與癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路和神經活性配體-受體相互作用信號通路等有關,故推測川芎-丹參藥對中的活性成分通過參與調控關鍵通路中的關鍵靶標基因表達而達到治療疾病的目的。本研究基于網絡藥理學方法挖掘川芎-丹參藥對的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡關系,進行GO和KEGG通路富集分析,有助于從基因和細胞組成層面揭示川芎-丹參藥對治療疾病的機制,進而為臨床應用川芎-丹參復方提供借鑒。