微小RNA-203b-3p調控多發性骨髓瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制研究

薛 靜, 郭 博, 胡 玲, 付 杏

(海南省婦女兒童醫學中心, 1. 檢驗科, 2. 血液腫瘤科, 海南 海口, 570000)

多發性骨髓瘤(MM)是一種克隆性B細胞惡性腫瘤,其特征是分化的單克隆漿細胞在骨髓中堆積[1-2]。MM被認為是世界上最難治愈的漿細胞惡性腫瘤之一,占所有血液學癌癥的13%以上[3]。由于耐藥性的產生,近年來MM的復發率呈逐漸升高趨勢[4]。微小RNA(miRNA)是一種高度保守的小型非編碼RNA分子,在基因的調控中起著關鍵作用。此外, miRNA可以通過轉錄或轉錄后調控相應的靶基因而影響癌細胞的增殖和轉移[5-7]。研究[8-10]表明, miRNA的異常表達與MM的發生和進展有關,這可能促使對人類MM機制發生新的認識。ZHAO Y等[11]研究表明,微小RNA-144-3p(miR-144-3p)通過靶向細胞間質上皮轉換因子(c-Met)抑制細胞增殖并誘導MM的凋亡。微小RNA-203(miR-203)在MM中通過靶向Bmi-1可以抑制細胞生長并調節G1/S轉換[12]。研究[13]顯示, miR-203b-3p在紫杉醇耐藥的腫瘤進程調控中同樣發揮作用。盡管如此, miR-203b-3p在MM細胞中的作用和功能仍然未知。

腫瘤壞死因子超家族成員13b(TNFSF13B)是一種B細胞激活因子(BAFF),主要由骨髓系細胞產生[14]。BAFF在B細胞的生存、增殖和分化中起著至關重要的作用,可以導致部分惡性腫瘤的發生和發展[15-16]。最近的研究[17]表明, BAFF/受體蛋白或TNFSF13BmRNA在系統性紅斑狼瘡和淋巴瘤中表現出異常的表達。本研究觀察MM細胞中miR-203b-3p與TNFSF13B的關系,探討miR-203b-3p影響MM細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本和細胞系

選取2020年2月—2022年7月在海南省婦女兒童醫學中心接受手術的30例MM患者的骨髓瘤組織和癌旁組織,其中男14例,女16例; 年齡35～67歲,中位年齡47歲。所有組織樣本放在-80 ℃的液氮中冷凍,以備日后實驗使用。本研究得到了本院倫理學委員會的批準,并獲得了所有受試者的書面知情同意書。MM細胞系(U266、RPMI-8226、LP-1和H929)和正常人骨髓基質細胞系(HS-27A)購自BeNa生物(中國北京)。

1.2 基因芯片分析

本研究從30對組織中隨機抽取了3對骨髓瘤組織和癌旁組織,然后進行RNA提取,并對RNA進行了鑒定分析。利用Affymetrix HUGene 2.0ST基因芯片(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)篩選出表達異常的mRNA。差異倍數>4或<-4和P<0.05被設定為篩選標準。基因芯片數據通過DNAstar軟件(Lasergene, Madison, WI)進行分析。

1.3 細胞培養、轉染和分組

細胞在RPMI 1640培養基(Sigma-Aldrich,美國)中加10% FBS和0.1%青霉素-鏈霉素培養,然后在37 ℃的培養箱中保存。miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過表達載體(TNFSF13 cDNA)由蘇州基因制藥有限公司(中國蘇州)合成,其中miR-203b-3p模擬物的序列為5′-ATCGCATCGACTACCATCACT-3′。使用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies, 美國)將LP-1細胞系分別轉染miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過表達的質粒。轉染后24 h檢測轉染效率。實驗分以下5組進行: 空白組(非轉染), NC組(轉染pcDNA3.1空白質粒), miR-203b-3p組(轉染miR-203b-3p模擬物), TNFSF13B組(轉染pcDNA3.1-TNFSF13B過表達質粒),以及miR-203b-3p+TNFSF13B組(共同轉染miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過表達質粒)。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測miR-203b-3p的表達水平

按照說明書使用TRIzol試劑(Beyotime,中國)和PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen)提取總RNA。使用TIANScript Ⅱ RT試劑盒(TIANGEN)進行RNA的反轉錄。PCR在MiniOpticon實時PCR系統(Bio-Rad)上進行,并使用SYBR-Green RealMastcrMix(Bio-Rad)進行擴增檢測。U6是miR-203b-3p的內參基因。miR-203b-3p或U6的相對表達量采用2-△△Ct方法測量。PCR引物是由Sangon Biotech(中國上海)制作的。miR-203b-3p的引物設計為加Poly A法: 正向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′, 反向5′-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3′;U6的引物是正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 蛋白質印跡分析(Western blot)檢測TNFSF13B的表達水平

本研究收獲處于對數期的細胞。使用RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich)進行總蛋白的提取,直到細胞生長達到80%匯合。采用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce, Rock ford, IL)鑒定蛋白濃度。蛋白質通過10%的SDS-PAGE(Bio-Rad)分離,然后按照指南放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)中。5%的脫脂牛奶涂抹在膜的密封處1 h, 然后在4 ℃下加入一級抗體抗TNFSF13B(ab8396, 1∶1 000, Abcam, 英國)和抗GAPDH(ab22555, 1∶1 000, Abcam, 英國)并孵育過夜,然后采用TBST沖洗膜3次,每次10 min。隨后將二抗HRP標記的山羊抗兔IgG H&L抗體(1∶2 000)加入到膜上,再孵育1 h, 之后采用TBST沖洗膜2次。通過增強型化學發光(ECL)檢測系統(Thermo Scientific)觀察免疫活性蛋白,并在顯微鏡下拍照(Bio-Rad)。β-actin作為內參蛋白用于檢測。

1.6 雙熒光素酶報告試驗檢測miR-203-3p與TNFSF13B的靶向關系

質粒pmirGLO和pGEM-T載體均購自Promega公司。PmirGlo-TNFSF13B 3′非翻譯區-野生型(3′UTR-wt)和PmirGlo-TNFSF13B 3′UTR-突變(3′UTR-mut)是由XL定點突變試劑盒(Qiagen)構建。將LP-1細胞放入帶有48孔的平板中。細胞在達到80%匯合度之前不進行轉染。使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑將miRNA(miR-203b-3p mimic或對照組)和載體(野生型或突變型)共同轉染到細胞中,然后在室溫下進行培養。轉染后24 h使用熒光素酶報告測定試劑盒(Promega)評估熒光素酶活性。

1.7 集落形成試驗和劃痕試驗

將細胞接種到60 mm的培養皿中,在37 ℃的潮濕環境下培養2周; 除去完整的培養基,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次; 采用0.1%的水晶紫染色20 min, 然后除去水晶紫溶液,采用甲醇固定集落,并對集落進行計數。上述實驗至少進行了3次。

收集細胞并置于48孔板中(每孔1×106細胞)。當細胞生長到75%匯合時,用無菌的200 mL微量吸頭來刮取單層細胞,隨后采用PBS洗2次脫落的細胞,然后培養24 h。在顯微鏡下觀察0、24 h的細胞劃痕愈合區。

1.8 Transwell侵襲試驗

為了檢查LP-1細胞的侵襲能力,將細胞置于轉孔板中,與無血清培養基(100 μL)混合后,在上腔加入Matrigel(BD Biosciences, 美國),然后在37 ℃下保存過夜; 采用胰蛋白酶裂解細胞,采用無血清培養基稀釋,將細胞(1×105)轉移到上腔。下室含有600 μL DMEM(Sigma-Aldrich)和10% FBS(Invitrogen)。培養24 h后,采用棉簽刮除非入侵細胞,采用甲醇和0.1%的水晶紫固定和染色遷移或入侵的細胞。采用光學顯微鏡(日本尼康)檢測侵入的細胞。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 miR-203b-3p在MM組織和細胞中的表達情況

為了檢查骨髓瘤組織和癌旁組織的表達情況,本研究通過基因芯片分析篩選出腫瘤組織和癌旁組織中異常表達的miRNA(圖1A)。選擇MM組織和細胞中低表達的miR-203b-3p mRNA作為研究靶基因,通過qRT-PCR檢測組織樣本中miR-203b-3p的表達。與癌旁組織相比, miR-203b-3p在腫瘤組織中的表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1B); 同時, miR-203b-3p在MM細胞系(U266、RPMI-8266、LP-1和H929)中的表達與正常骨髓基質細胞系(HS-27A)相比降低,差異有統計學意義(P<0.05)(圖1C)。選擇miR-203b-3p表達水平最低的LP-1細胞系進行后期實驗。

2.2 TNFSF13B是MM細胞中miR-203b-3p的靶基因

TargetScan數據庫預測,在TNFSF13B的3′UTR-wt區有1個miR-203b-3p的直接結合點(圖2A)。與miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-wt共轉染組相比,細胞的熒光素酶活性降低,差異有統計學意義(P<0.05), 而miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-mut共轉染組與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)(圖2B)。本研究證實miR-203b-3p直接針對TNFSF13B。Western blot檢測結果表明,與正常細胞相比,腫瘤組織和MM細胞中TNFSF13B蛋白水平的表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2C、2D)。

A: TargetScan預測在TNFSF13B的3′UTR中存在miR-203b-3p的直接結合位點; B: 與對照組相比, miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-wt的共轉染顯著降低了熒光素酶活性,而miR-203f-3p模擬品和TNFSF1 3B 3′UTR-mut的共轉染組與對照組無顯著差異; C: Wesfern blot檢測顯示腫瘤組織中TNFSF13B蛋白的表達顯著高于正常鄰近組織; D: Wesfern blot檢測顯示TNFSF13B蛋白在MM細胞系(U266、RPMI-8226、LP-1和H929)中的表達顯著高于正常人骨髓基質細胞系(HS-27A)。與對照組比較, *P<0.05; 與正常組織比較, #P<0.05; 與HS-27A比較, △P<0.05。

2.3 miR-203b-3p對MM細胞的增殖和轉移的影響

miR-203b-3p和miR-203b-3p+TNFSF13B均能促進miR-203b-3p的表達,差異有統計學意義(P<0.05), 而TNFSF13B對miR-203b-3p的表達無影響,差異無統計學意義(P>0.05)(圖3A)。miR-203b-3p能夠抑制TNFSF13B的表達,而TNFSF13B組表現為促進了TNFSF13B的表達(P<0.05)(圖3B)。此外,集落形成實驗結果表明, miR-203b-3p抑制了MM細胞的增殖,而TNFSF13B促進了MM細胞的增殖,差異有統計學意義(P<0.05)(圖3C)。劃痕試驗結果顯示, MM細胞的遷移受到miR-203b-3p的抑制,而TNFSF13B則促進其遷移,差異有統計學意義(P<0.05)(圖4A); 侵襲試驗結果表明, miR-203b-3p抑制了MM細胞的侵襲,而TNFSF13B增強了MM細胞的侵襲,差異有統計學意義(P<0.05)(圖4 B)。

A、B: miR-203b-3p組和miR-203b3p+TNFSF13B組的miR-203b-3p的表達水平高于對照組, qRT-PCR和Wesfern blot檢測顯示,與對照組比較, miR-203b-3p組的TNFSF13B表達較低, TNFSF13B組的TNFSF13B表達較高, miR-203b-3p+TNFSF113B組的miR-203b-3p和TNFSF13B組的miR203b-3p表達與對照組無顯著差異; C: 集落形成試驗采用結晶紫染色,放大倍數40倍,miR-203b-3p組MM細胞的集落數量低于對照組,而TNFSF13B組MM細胞集落數量高于對照組, miR-203-b-3p+TNFSFF13B組的集落數與對照組無顯著差異。與空白組(Mock)或對照組比較, *P<0.05。

A: 傷口愈合試驗表明(比例尺為100 μm), miR-203b-3p組的遷移率低于對照組,而TNFSF13B組的遷移速率高于對照組,miR-203b-3p+TNFSF13B組與對照組、NC組無顯著差異; B: Transwell分析表明(結晶紫染色,放大倍數40倍,比例尺為50 μm), miR-203b-3p組的侵襲細胞數低于對照組,而TNFSF13B組的侵襲細胞數高于對照組,miR-203b-3p+TNFSF113B組與對照組、NC組無顯著差異。與對照組比較, *P<0.05。

3 討 論

本研究結果顯示, miR-203b-3p的表達在MM組織及細胞中顯著下調,并驗證了miR-203b-3p在MM細胞中能夠靶向調控TNFSF13B的表達,同時還證明了miR-203b-3p通過抑制TNFSF13B對MM細胞的生物學功能產生了抑制作用。

miRNA已經被證實可以調節各種生物過程。研究[18-19]顯示, miRNA在腫瘤中失調,包括MM。miR-21能夠調控MM細胞的增殖能力。YANG Y J等[20]驗證了miR-137/197調節MM細胞的活力、克隆形成和遷移。miR-203b-3p在包括肝細胞癌和結腸癌等多種腫瘤中的作用也相繼被證實[21]。ZHANG C Y等[22]研究結果顯示, miR-203在三陰性乳腺癌(TNBC)中被下調,從而抑制了TNBC細胞的增殖和遷移。與既往研究結果類似,本研究結果顯示, miR-203b-3p在MM細胞中下調,并抑制MM細胞的增殖和轉移。這是通過特異性結合TNFSF13B而實現的。miR-203b-3p已被發現通過靶向各種基因來抑制各種腫瘤的侵襲性。AN N等[23]發現, miR-203b-3p靶向CASK導致胃癌細胞的增殖和侵襲性降低。WU S Q等[12]發現,通過靶向Bmi-1恢復miR-203b-3p能明顯抑制MM細胞的生長和G1/S轉換。YANG P S等[24]發現, miR-203b-3p通過靶向CREB1 mRNA抑制了MM的細胞增殖。復雜的miRNA網絡參與了癌癥的發展。miR-203b-3p被認為通過靶向各種基因影響MM以及其他癌癥的發展。本研究驗證了MM細胞中miR-203b-3p和TNFSF13B之間的新型分子調控網絡。

TNFSF13B屬于TNF超家族,該家族已被證明是細胞活動的重要調節器。TNF家族的2個成員APRIL和BAFF, 已被發現在許多癌癥中高表達,包括MM[25]。BRUNETTI G等[26]證明, TNFSF14在MM中促進破骨細胞生成而抑制成骨細胞生成。ZHU X J等[27]研究表明, TNFSF13B在免疫性血小板減少癥患者中表達升高。在MM晚期患者血清中發現TNFSF13B升高與骨髓瘤細胞的生長有關[28]。然而, TNFSF13B在MM細胞中的作用尚不明確。本研究證實了TNFSF13B對MM細胞活性的調節機制。本研究結果顯示, TNFSF13B在MM組織和細胞中明顯上調。此外,本研究通過克隆形成實驗、劃痕實驗和侵襲實驗證實了TNFSF13B促進了MM細胞的增殖和轉移。

綜上所述, miR-203b-3p可能通過靶向調控TNFSF13的表達來抑制MM細胞的增殖、遷移及侵襲。這些發現不僅為深入研究miR-203b-3p在MM細胞中的作用機制提供了科學依據,而且為MM的臨床治療提供了一種新的潛在治療策略。