‘沙糖橘’S蛋白同源基因CrSPH的克隆與表達分析

吳秀蘭,唐文武,徐呈祥,李桂花

(1 肇慶學院 食品與制藥工程學院,廣東肇慶 526061;2 肇慶學院 生命科學學院,廣東肇慶 526061;3. 廣東省農業科學院蔬菜研究所,廣州 510640)

在顯花植物中,自交不親和性(self-incompatibility,SI)被認為是防止自花授粉、促進異花授粉及產生新基因型的重要遺傳機制。SI是由1個單一的復等位基因S位點所控制,以實現接受還是排斥自我的花粉[1]。SI系統可分為孢子體SI(sporophytic SI,SSI)和配子體SI(gametophytic SI,GSI)。SSI和GSI由不同的S位點基因控制,以十字花科為代表的SSI 主要由S位點的SRK(S-receptor kinase)和SCR(S-locus protein 11)基因控制[2]。這2個緊密連鎖的S位點基因在柱頭的乳突細胞中特異性表達,并在SI中控制柱頭的功能[3]。以茄科為代表的GSI主要由雌蕊中的S-RNase和花粉中SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-spectific F-box)基因控制[4]。有關S-RNase研究較多,玄參科[5]、薔薇科[6]、蕓香科[7]、在茄科[8]等均有報道,不同S-RNase之間存在高度的多態性,其氨基酸序列的同源性介于38%～98%之間[9]。在花粉S位點基因研究方面,Lai等[10]從金魚草的BAC文庫中篩選到1個AhSLF-S2基因,該基因與S2-RNase緊密連鎖。Sassa等[11]在梨中鑒定了5個F-box基因,均位于Sn-RNase基因附近。Beecher等[12]報道除了關鍵S因子外,其他非關鍵因子也參與自交不親和反應,如PCD[13]、SSK1[14]、CrSKP1-e[15]、BrCML49[16]等。

柑橘屬于S-RNase介導的GSI,由花柱S-RNase和花粉SLF相互作用,通過抑制花粉管的生長實現自交不親和性[17]。當花柱S-RNase進入花粉管后,非自我S-RNase會被SLF識別并被泛素化及降解,花粉管能正常延伸至子房受精。當自我S-RNase釋放到花粉管中,會降解花粉管中的RNA,使得花粉管無法在花柱中生長,表現出自交不親和反應[18]。沙糖橘是中國重要的柑橘品種,屬于自交親和品種。‘無籽沙糖橘’是‘沙糖橘’的芽變體,屬于GSI[19-20],是研究自交不親和的理想材料。課題組前期從無籽沙糖橘SSH文庫中篩選到1個自交不親和相關的EST序列,序列比對為S-蛋白同源基因(S-protein homologous gene,SPH),柑橘SPH基因的相關研究尚未見報道。本研究以甜橙(Citrussinensis)的SPH基因序列(Cs5g34580.1)為參照,克隆了‘沙糖橘’CrSPH基因的CDS和DNA序列,并分析其在花器官不同部位、授粉后不同時段的表達量,同時研究該蛋白對‘無籽沙糖橘’、‘沙糖橘’花粉萌發率的影響,以期為研究CrSPH基因功能及在柑橘自交不親和反應中的作用機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用‘無籽沙糖橘’及‘沙糖橘’果樹由肇慶市德慶縣馬圩鎮果園提供,為7年生果樹。于2019年春季收集含苞待放花蕾,用鑷子剝離出花瓣、花絲、柱頭、花柱、子房、花絲和花藥,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱,用于不同組織表達分析。收集自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)、異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱,用于授粉后不同時段的表達分析。收集‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’花粉,置于-20 ℃冰箱保存,用于體外花粉萌發實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1CrSPH基因克隆

采用RNA提取試劑盒提取總RNA,采用CTAB法[21]提取基因組DNA,采用Life Technology公司生產的M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA。參考甜橙SPH基因序列(Cs5g34580.1)設計1對包含起始密碼子和終止密碼子的引物CrSPH-F/R(表1),擴增CrSPH基因的CDS和DNA序列,擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收,獲得目的基因片段。將目的基因與pMD19-T克隆載體連接并轉化感受態細胞DH5α,經37 ℃過夜培養后,挑取3個陽性菌落經PCR鑒定正確后,送基因測序公司測序驗證。

表1 所用引物序列

利用 NCBI的blastp 對CrSPH基因序列和蛋白序列進行分析,采用ProtParam在線工具分析蛋白質的等電點及分子量。利用在線軟件SignalP 6.0對CrSPH蛋白進行信號肽分析。

1.2.2 qPCR表達分析

為分析CrSPH基因在花器官的不同部位及授粉后不同時段的表達量,利用qPCR技術檢測花瓣、子房、花柱、柱頭、花絲和花藥等花器官,以及自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)、異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)授粉后不同時段的基因表達量。根據CrSPH基因和柑橘Actin基因序列,分別設計符合qPCR要求的特異引物(qCrSPH-F/R)和內參引物(Actin-F/R)(表1),按照qPCR試劑盒(SYBR Green)說明書進行qPCR反應,反應體系為20.0 μL,包括10.0 μL SYBR ExTaq,10 μmol/L引物各1.0 μL,6.0 μL ddH2O和2.0 μL(80 ng) cDNA,擴增反應在ABI 7500實時定量PCR儀進行。設置3次重復,每次用ddH2O做陰性對照,數據分析采用2-ΔΔCT法計算[22]。

1.2.3 Southern雜交分析

以10.0 μg基因組DNA為模板,分別用限制性內切酶EcoR Ⅰ、ScaⅠ、ClaⅠ于37 ℃過夜消化,全部酶切產物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳3～5 h,待全部產物分離后凝膠成像系統拍照,將其轉入Hybond N+尼龍雜交膜。根據PCR DIG探針合成試劑盒說明書合成帶有DIG標記的探針,于42 ℃預雜交2 h后,加入制作好的探針過夜雜交;然后用2×檸檬酸鈉(stand saline citrate,SSC)溶液(含0.1% SDS),再用0.5×SSC(含0.1% SDS)于65 ℃洗脫2次,每次洗脫10 min;最后于暗室中將X-ray膠片平鋪到雜交膜并置于暗匣中,于37 ℃曝光5～30 min。

1.2.4 原核表達載體構建及CrSPH蛋白誘導

設計含有BamH I和SalI酶切位點的引物pET32a-CrSPH-F/R(表1),以pMD19-CrSPH為模板擴增目的基因,獲得帶有黏性末端的目的基因。用BamH I和SalI雙酶切線性化原核表達載體pET32a,將帶有黏性末端的目的基因與線性化的表達載體用T4DNA酶連接,經轉化、鑒定后獲得pET32a-CrSPH重組原核表達載體。將上述重組質粒轉化至大腸表達菌株BL21(DE3),以空質粒為對照。用1 mmol/L IPTG誘導菌株表達獲得pET32a-CrSPH融合蛋白,并經12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.5 花粉萌發實驗

將原核誘導的CrSPH蛋白稀釋成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 μg/μL 5個濃度。花粉培養基配制按照Miao等[26]的方法,分別取上述各濃度的‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’CrSPH蛋白200 μL,加入到上述花粉培養基后分成2份:一份用于‘無籽沙糖橘’花粉培養,一份用于‘沙糖橘’花粉培養。相應花粉撒播至培養基后于恒溫培養箱中28 ℃培養10 h,以花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發標準,在光學顯微鏡下觀察并統計各處理的花粉萌發率,設置3次生物學重復,以未添加CrSPH蛋白組作為對照。

2 結果與分析

2.1 CrSPH基因克隆

以‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的花蕾 cDNA 為模板,利用引物CrSPH-F/R進行PCR擴增,均得到約400 bp特異條帶(圖1),經回收、克隆后測序表明‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’CDS均為417 bp,編碼138個氨基酸。兩者間序列存在3個堿基差異,‘沙糖橘’第93位C突變為T、第190位G突變為A、第324位C突變G,從而導致‘沙糖橘’第64位纈氨酸(V)突變為異亮氨酸(I),108位天冬酰胺(N)突變為賴氨酸(K)(圖2)。利用CrSPH-F/R引物對2個材料的基因組DNA進行擴增及測序,其序列長度也是417 bp,表明‘沙糖橘’和‘無籽沙糖橘’基因組DNA均不含內含子。利用ProtParam預測‘沙糖橘’CrSPH蛋白顯示其分子量為16.05 kD,理論等電點為8.48,SignalP 6.0分析顯示該蛋白不存在信號肽。

M. Marker; 1. Wuzishatangju; 2. Shatangju.

STJ. Shatangju; WZSTJ. Wuzishatangju.

2.2 不同部位花器官的基因表達分析

采用qPCR技術對花瓣、花絲、花藥、柱頭、花柱和子房等花器官部位的CrSPH基因表達量進行檢測,結果如圖3所示,CrSPH基因在‘沙糖橘’花器官不同部位的表達量差異較大,其中子房組織的表達量最高,且與其他部位表達量差異均達到顯著水平;‘無籽沙糖橘’不同部位的表達量差異均未達到顯著水平。在高表達的子房中,‘沙糖橘’表達量是‘無籽沙糖橘’的16倍,表明CrSPH基因在‘沙糖橘’中具有高度的組織表達特異性。

柱狀圖上不同小寫字母表示花器官不同部位表達量差異顯著(P<0.05)。

2.3 自交和異交授粉后不同時段的基因表達分析

利用qPCR檢測了CrSPH基因在自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)和異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)授粉后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊組織表達量,相關結果見圖4。由圖4可知,異交授粉后第6,7天的表達量最高,與其他時段的差異均達到顯著水平;異交授粉后第2～4天的表達量較高,與表達量較低的第1和第5天的差異達到顯著水平,異交授粉第6天表達量是第1天表達量的12.4倍,表明CrSPH基因在異交授粉后不同時段的表達量差異顯著。

柱狀圖上不同小寫字母表示授粉后不同時間的表達量差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知,自交授粉后各時段的基因表達水平較低,其表達量呈現出先上升后下降的表達規律,以第3天的表達量最高,但不同時段的基因表達量差異未達到顯著水平。

2.4 Southern 雜交分析

利用CrSPH基因內部不存在酶切位點的EcoR I和SacI酶以及存在1個酶切位點的ClaI酶對基因組DNA消化后,與DIG標記CrSPH基因的探針進行雜交實驗,結果見圖5。由圖5可知,經EcoR I和SacI消化的DNA雜交出1條雜交帶,而經ClaI酶消化的DNA出現2條雜交帶,表明CrSPH基因在‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’基因組中均以單拷貝形式存在。

A.‘Wuzishatangju’, B. ‘Shatangju’.

2.5 CrSPH蛋白誘導表達及對離體花粉萌發影響

將線性化的pET32a表達載體與帶有BamH I和SalI酶切位點的目的基因連接后,經轉化、培養、測序鑒定后,成功構建含有CrSPH基因的原核表達載體pET32a-CrSPH。將該重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導表達及SDS-PAGE電泳結果見圖6。由圖6可知,原核誘導表達的融合蛋白條帶約37 kD,其中CK中的標簽蛋白為21 kD,誘導獲得的CrSPH蛋白約為16 kD,這與生物信息學預測的16.05 kD結果相吻合,表明該原核表達系統成功誘導表達出CrSPH蛋白。

M. Marker; CK. His tags protein; 1. ‘Wuzishatangju’;2. ‘Shtangju’.

將上述異源表達的CrSPH蛋白稀釋成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 μg/μL濃度后添加到花粉培養基,觀察其對花粉萌發率的影響,并以不添加外源CrSPH蛋白組為對照,結果見圖7。由圖7可知,‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白對2種花粉萌發率有一定影響,隨著異源‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白濃度增加,‘無籽沙糖橘’花粉萌發率顯著性降低;但‘沙糖橘’花粉在0.4,1.6 μg/μL的低濃度處理時萌發率較高,而在3.2,6.4 μg/μL的高濃度處理下萌發率反而下降。‘沙糖橘’CrSPH蛋白對‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的花粉萌發均無明顯影響。

圖柱上不同字母表示不同濃度處理下的差異顯著性(P<0.05),*表示兩材料間差異達到顯著水平(P<0.05),**表示兩材料間差異達到極顯著水平(P<0.01)。

3 討 論

多數果樹屬于配子體自交不親和,其自交不親和性是雌蕊關鍵因子S-RNase基因和花粉關鍵因子SLF/SFB基因相互作用結果[7,17,23-25]。Lai等[10]在研究金魚草花粉自交不親和反應中,將金魚草花粉特異表達AhSLF-S2基因和雌蕊特異表達的AhS2-RNase基因轉入矮牽牛(Petuniahybrida),結果分別在轉基因矮牽牛的花粉和雌蕊中檢測這兩個基因的表達量,Qiao等[26]進一步通過花粉實驗證明轉了AhSLF-S2和AhS2-RNase基因的矮牽牛由SI轉變成SC。然而薔薇科花粉自交不親和反應并非由于基因表達量差異導致,而是花粉S基因編碼區發生了堿基的替換、缺失,導致S蛋白發生改變,從而導致由SI向SC轉變[27]。Sassa等[4]發現SC突變體‘Osa-Nijisseiki’是由于SI日本梨‘Nijisseiki’的S4-RNase基因發生了突變,使得S4-RNase基因不能在花柱表達,導致SI向SC突變。Ushijima等[28]在梅(Prunusmume)中獲得花粉突變造成的自交親和單體型Sf,Sf基因結構中有6.8 kbp堿基插入,造成編碼的F-box蛋白缺少了C-端序列,從而造成親和突變。本研究中,CrSPH基因在‘沙糖橘’和‘無籽沙糖橘’CDS序列存3個堿基的差異(C→T,G→A,C→G),導致2個氨基酸殘基發生改變(V→I,N→K)。在CrSPH基因在特異性表達的子房部位,‘沙糖橘’表達量是‘無籽沙糖橘’的16倍,推測‘無籽沙糖橘’的CrSPH基因突變和子房中低水平表達可能與其自交不親和表型相關。

植物自交不親和主要由1個單一的復等位基因S位點控制,該基因座上存在2個緊密連鎖且分別在花柱和花粉中特異表達的基因,分別是雌蕊決定因子S-RNase和花粉決定因子SLF/SFB。柑橘屬于S-RNase介導的GSI,主要通過抑制花粉管的生長實現自交不親和性,因此S位點蛋白在花粉萌發和抑制花粉管生長中起著重要的作用[17]。Zhang等[18]提出泛素蛋白降解和液泡分揀途徑假說,認為S-RNase通過細胞內吞作用從細胞外基質進入到花粉管后被運輸到花粉的液泡中,在異花授粉的花粉管中,液泡膜未被破壞,S-RNase會被SCFCLF泛素化而降解,花粉管正常延伸;而自花授粉后,液泡膜由于某種機制會被破壞,S-RNase便釋放到細胞質中,產生細胞毒素效應從而抑制自花花粉管的生長。SI除了雌蕊決定因子S-RNase和花粉決定因子SLF外,其他非S因子也參與自交不親和反應。Beecher等[12]等發現通過轉化單一的S-RNase基因不一定能夠使自交親和的煙草品種恢復拒斥自花花粉的能力,說明SI除了花粉和花柱S決定因子外,其他非關鍵因子也參與自交不親和反應。Goldraij等[29]報道了HT-B作為非S因子可使不親和花粉管中的液泡破裂,使得S-RNase酶從液泡中釋放出來,從而抑制了花粉管生長。Thomas等[13]報道了PCD等非S因子不參與花粉管生長尖端的生長抑制,可能參與SI下游事件來保證花粉管生長抑制的不可逆性。Ren等[15]從無籽沙糖橘中克隆到1個CrSKP1-e基因,在花粉中特異表達,是SSK1基因的同源基因并參與SI反應。本研究中,CrSPH作為S位點蛋白的同源基因,CrSPH蛋白對花粉萌發表型效應也有顯著影響,隨著‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白濃度增加,‘無籽沙糖橘’花粉萌發率顯著性降低;而‘沙糖橘’花粉在低濃度CrSPH蛋白處理時萌發率較高,在高濃度處理時萌發率下降,因此,筆者推測CrSPH蛋白作為非關鍵因子,可能通過參與花粉管液泡破裂或其他下游代謝過程參與柑橘SI反應過程,但具體如何作用,需要進一步遺傳研究和功能驗證。