PARMS分子標記檢測方法在番茄種質資源鑒定中的應用

石雪燕李濤王虹云張瑞清曹守軍張麗莉姚建剛劉佳鳳黃代峰

(1.山東煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265599；2.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005)

番茄(Solanum lycopersicum L.)果肉酸甜可口鮮嫩多汁，營養價值高，加工食用方法多樣，深受人們喜歡，栽培地區廣泛，是最具有經濟效益的園藝作物之一。黃化曲葉病毒病是番茄的主要病害之一，被侵染后番茄葉片變小變厚變黃邊緣卷曲，植株無法正常發育，以帶有病毒的煙粉虱為主要媒介傳播，由于煙粉虱繁殖能力強，防治困難，進而造成黃化曲葉病毒病發病加重[1]。番茄葉霉病是由病原體(Cladosporium fulvum)侵染造成的，葉片侵染后出現褐色的霉菌斑塊[2]嚴重時番茄果實上會出現黑色的斑點導致果實硬化不能食用[3]。番茄頸腐根腐病是由尖孢鐮孢菌番茄頸腐根腐病專化型(Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici，Forl)侵染引起的一種土傳病害[4]，幼苗期從發病部位折倒而亡，5片葉后發病植株直立但是莖基部壞死，導致植株萎蔫死亡[5]。番茄極易受到病害影響導致產量和果實品質不佳，選育含有抗病基因的優良品種是最直接有效避免病害的方法。

五引物擴增受阻突變體系技術(PARMS)是在四引物擴增受阻突變體系(ARMS)的基礎上開發出的通過熒光檢測對SNPs或特定位點上的InDels進行精準的雙等位基因判斷[6，7]，在PARMS中，2種不同的通用引物被添加到引物的末端，通用熒光引物在擴增系統的參與下，將不同的基因型擴增以獲得不同的熒光基團，檢測樣品僅通過PCR擴增一次，無需電泳檢測，擴增數據通過熒光掃描儀直接從原始板中獲得[8，9]。

本研究對番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3，番茄葉霉病抗病基因Cf-9，番茄頸腐根腐病抗病基因Frl分別進行PARMS鑒定，以對PARMS檢測方法在番茄育種材料中的應用進行綜合評價。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

實驗材料為山東省煙臺市農業科學研究院蔬菜花卉所提供的134份番茄種質資源材料，見表1，種植在煙臺農科院蔬菜基地，采集新鮮健康的番茄葉片液氮固定，-80℃保存以備后續實驗。

表1 PARMS檢測結果及田間鑒定

1.2 DNA的提取

使用的試劑為動物及多糖多酚雙超mix試劑盒，購自北京聚合美科技有限公司(Mei5 Biotechnology Co.，Ltd)。取番茄葉片0.5cm2，加入加強型擴增最佳伴侶50μL充分研磨，沸水浴5min，12000rpm離心2min，得到番茄樣品DNA模板，-20℃保存。

1.3 PARMS檢測方法

反應體系為10μL：1μL DNA模板(50ng·μL-1)，5μL PARMS mix(2×)，0.45μL引物，3.55μL ddH2O。 PARMS-PCR擴增體系：94℃ 15min；94℃ 20s，65℃ 1min(-0.7℃/循環)，10個循環；94℃ 20s，57℃ 1min，35個循環；35℃ 1min。利用Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6讀取擴增產物的終點信號，使用其自帶的軟件進行分型分析。其中，連接FAM熒光標簽序列的等位基因型聚合在X軸附近，連接HEX熒光標簽序列的等位基因型聚合在Y軸附近，2種等位基因的雜合型在中間顯示。由武漢景肽生物科技有限公司(Gentides Biotech Co.，Ltd)檢測。

1.4 田間鑒定

134份種質資源材料分別于2020年、2021年、2022年春秋兩季在田間進行種植，拉秧期對番茄黃化曲葉病、番茄葉霉病、番茄頸腐根腐病的發病情況進行調查。

2 結果及分析

對134份番茄材料進行PARMS檢測，結果見圖1。

注：橫縱坐標值表示HEX與FAM熒光信號強度值；每1個圓點代表1份檢測材料，藍色代表抗性純合材料，綠色代表沒有抗性純合材料，紅色代表雜合材料，灰色代表游離在外無法判定，黑色代表沒有擴增信號。

經檢測含有Ty-1純合基因的番茄材料43份，含有Ty-1雜合基因的番茄材料14份，不含Ty-1基因的番茄材料69份，未檢出Ty-1基因的番茄材料8份；含有Ty-2純合基因的番茄材料36份，含有Ty-2雜合基因的番茄材料2份，不含Ty-2基因的番茄材料90份，未檢出Ty-2基因的番茄材料6份；不含Ty-3基因的番茄材料100份，未檢出Ty-3基因的番茄材料34份。含有Cf-9純合基因的番茄材料44份，含有Cf-9雜合基因的番茄材料19份，不含Cf-9基因的番茄材料59份，未檢出Cf-9基因的番茄材料12份。含有Frl純合基因的番茄材料50份，含有Frl雜合基因的番茄材料5份，不含Frl基因的番茄材料73份，未檢出Frl基因的番茄材料6份。

結合田間鑒定及表1中PARMS檢測結果發現，采用PARMS方法檢測Ty-1抗病基因有8份材料未檢出，分別是CH-20、CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7、ML-54；Ty-2抗病基因有6份材料未檢出，分別是CH-5、CM-17、RS-12、FW-34、MS-85、SG-56；Ty-3有34份材料未檢出，Ty-1和Ty-3為1對復等位基因，理論上只存在1個，攜帶Ty-1抗性為智利番茄LA1969來源，攜帶Ty-3抗性為智利番茄LA2779來源。根據田間鑒定結果表明，CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7為抗病材料，CH-20、ML-54為感病材料。綜合田間調查及Ty分子標記檢測，Ty-1標記與番茄Ty抗性有很大相關性。Cf-9抗病基因有12份材料未檢出，分別是CL-11、CM-17、CS-22、PJ-2、CT-45、CM-33、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43、ML-13、SD-6，根據田間鑒定結果顯示，CS-22、CT-45、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43抗葉霉病，CL-11、CM-17、PJ-2、CM-33、ML-13、SD-6為感病材料。Frl抗病基因有6份材料未檢出，分別是CH-20、CS-21、TY-19、SG-43、JF-14、DF-56，根據田間鑒定結果顯示，TY-19、SG-43、JF-14、DF-56為抗病材料，CH-20、CS-21為感病材料。

3 討論

隨著分子生物學在農學領域的大量應用，分子標記輔助育種成為一種有效的育種手段，與傳統育種方式相比，分子育種便捷準確能縮短育種年限[10]，是當前的研究熱點。與普通PCR技術相比，常規PCR成本較低，一般實驗室內均可操作，但實驗結果受操作方法影響大，檢測步驟繁瑣、效率低，無法快速完成大量的檢測任務，使得大批量常規PCR檢測受到限制[11]，而通過熒光檢測的PARMS技術可進行批量檢測，周期短、檢測效率高，檢測結果的準確率比常規PCR高[9，12]。

本研究利用PARMS分子標記檢測技術，對134份番茄材料的5個抗病基因進行了檢測，并通過田間調查對檢測結果進行了驗證。經綜合評價，PARMS技術準確性為95%以上，檢測效率高，適于大批量檢測，可作為今后番茄育種材料抗病性檢測的輔助手段。