暗培養時間對汕農幸運女神和汕農福星蝴蝶蘭叢生芽增殖率的影響初探

王春丹 張秀珊 王健蓉 林天友 蘇鎮祥 陳桂玲 曾寶珰

(汕頭市農業科學研究所，廣東 汕頭 515021)

蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)別名蝶蘭，蝴蝶蘭屬熱帶或亞熱帶的單莖性氣生蘭，其花形似蝴蝶飛舞，色彩艷麗且顏色多樣，有純色的紅、黃、白、綠、紫紅、深紅、粉紅、橙紅，也有白花黃心、黃花紅心、紫花白邊等。花朵的品種不同，花的大小也有差異。大花品種花朵甚至超過15cm，大小接近人的手掌，小花品種有的小于2cm，小巧玲瓏。唇瓣的花色及形狀變化也是十分豐富，極具觀賞價值。有些花種不僅顏色美，花型好，更是帶著淡淡的香味，讓人喜愛。蝴蝶蘭花期可長達數月，植株外型美觀，素有“洋蘭皇后”之稱，與卡特蘭、萬代蘭、石斛蘭并稱為4大觀賞蘭[1]。蝴蝶蘭常野生于熱帶高溫、多濕的中低海拔山林中，喜高溫、多濕、散射光及通風良好的環境，忌悶熱及強光。適宜的生長溫度白天為25～28℃，晚間為18～20℃。溫度高于35℃或低于10℃時，蝴蝶蘭停止生長。晝夜溫差最好達到5～8℃，有利于蝴蝶蘭的生長。蝴蝶蘭被視為“愛情、純潔、美麗”的象征，一直以來在花卉市場備受歡迎，每年春節都能看到其身影。顏色美、株形好的蝴蝶蘭備受寵愛，走入了千家萬戶。質量高、品質好的蝴蝶蘭更是市場所需求的，這就對蝴蝶蘭種苗的大規模生產起到推動作用。提高蝴蝶蘭優良品種的繁殖速度，對培育大批量優質種苗意義重大，有利于進一步擴大生產規模。加強和完善蝴蝶蘭離體培植技術體系的研究，可更好為其提供有力條件。

蝴蝶蘭種子如灰塵，小而輕，沒有胚乳。在自然條件下，種子的萌發率極低，無法利用播種方式有效繁殖，植株也很少發育側芽，很難采用常規分株方式進行無性繁殖。蝴蝶蘭組培選取帶休眠芽的幼嫩花梗作為外植體誘導出不定芽，進而產生叢生芽，叢生芽經過增殖可直接成苗。蝴蝶蘭叢生芽途徑的優點，不僅僅是誘導率高，所用時間短，增殖率高，而且性狀穩定，變異率低，可全年生產等，且所繁育的種苗能較好保持親本的優良性狀，能滿足蝴蝶蘭規?；a的需求，因此已成為蝴蝶蘭種苗生產最有效的手段[2]。

植物組織培養是以植物生理學為基礎發展起來的一項技術。經過各國科學家多年探索，當前幾乎所有的植物器官、組織或細胞都能離體培養成功[3]。目前，與蝴蝶蘭組織培養技術研究方面相關的文獻較多[4-8]，蝴蝶蘭組培技術比較成熟，但不同品種之間的組培條件差異較大，這就要求對于組織培養技術方面研究要更為細化。有關暗培養對增殖率影響的研究少有報道。本文以汕頭市農業科學研究所自主選育的蝴蝶蘭優良新品種“汕農幸運女神”(粵評花20220007)、“汕農福星”(粵評花20220004)在繼代階段的叢生芽為材料，初步探索暗培養時間對“汕農幸運女神”“汕農福星”蝴蝶蘭叢生芽繼代增殖的影響，為現有的蝴蝶蘭快速繁殖體系添磚加瓦，降低組培成本，為蝴蝶蘭相關生產企業提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為汕頭市農業科學研究所自主選育的“汕農幸運女神”“汕農福星”蝴蝶蘭經叢生芽途徑的繼代材料。

1.2 方法

選取芽體生長基本一致的單芽，每瓶接種11個芽，培養基為1/2MS加6-BA 7mg·L-1加Ad 5mg·L-1加白糖20g·L-1加椰汁100mg·L-1加瓊脂4g·L-1，pH5.8。

將接種后的材料進行暗培養，設7個處理，暗培養天數分別為0d(處理1)、10d(處理2)、20d(處理3)、30d(處理4)、40d(處理5)、50d(處理6)、60d(處理7)，每個處理設置3次重復，每個重復5瓶，共15瓶。在達到暗培養天數后轉入培養溫度為26±2℃、光照強度為2000～2500lx的培養室中培養。繼代培養周期為60d，轉瓶時記錄每瓶芽數，計算每個處理每瓶平均芽數，計算平均增殖系數。

1.3 增殖系數計算

計算公式：

增殖系數=每瓶平均芽數/每瓶接種芽數

2 結果與分析

2.1 “汕農幸運女神”暗培養處理1～7叢生芽增殖情況

從圖1可知，處理1單芽基部長出新的叢生芽，新芽葉色濃綠，芽體較粗壯，但新芽數量較少；處理2～5萌發的新芽呈翠綠色，芽數比處理1明顯增加；處理6～7萌發的新芽呈嫩綠色，芽數比其它處理明顯增加。光照時間長短不同，各個處理的蝴蝶蘭苗顏色也略有差別，其中，處理6經過50d的暗培養，新芽的顏色偏白，雖有10d光照，顏色尚未恢復為綠色。處理7在無光照的條件下，葉片得不到足夠的光照，不能形成葉綠素，使得新芽生長緩慢，芽體弱小，顏色偏白色，有的新芽更是略透明，但新芽數量最多，見圖2，之前所接的單芽和新生芽形成一簇，緊密相挨。

注：圖片編碼A1～A7分別對應不同暗培養天數。

圖2 處理7(暗培養60d)

2.2 “汕農幸運女神”“汕農福星”經過不同暗培養天數后叢生芽的增殖情況

從表1、表2可知，隨著暗培養天數的增加，2個品種的增殖系數隨著增大，見圖3。當材料暗培養至60d時，增殖系數最高，“汕農幸運女神”增殖系數達到6.73，而“汕農福星”的增殖系數達到5.81。

表1 不同暗培養天數“汕農幸運女神”叢生芽增殖情況

表2 不同暗培養天數“汕農福星”叢生芽增殖情況

圖3 “汕農幸運女神”和“汕農福星”增殖系數折線圖

3 討論與結論

目前，蝴蝶蘭組織培養研究大多采用原球莖途徑[9，11]，相比原球莖途徑，叢生芽的報道較少。叢生芽的組織培養途徑誘導率高，性狀穩定，同時所用時間短，節約了時間成本，蝴蝶蘭叢生芽的組織培養途徑的增殖率高，可達3～6倍，相比其他，技術難度低，性狀穩定，這就避免了變異的產生，對大規模的生產意義重大。

組織培養是蝴蝶蘭快速繁殖的主要途徑，在合理高效利用有限外植體的前提下，提高蝴蝶蘭不定芽的增殖率就可以提高蝴蝶蘭的繁殖速度。從試驗結果來看，通過增加暗培養時間明顯提高“汕農幸運女神”“汕農福星”不定芽的增殖率。在單一個繼代周期內，隨著暗培養天數的增加增殖率逐漸提高，見圖3，經過60d暗培養供試2個品種的叢生芽增殖率最高，達到6.73和5.81。從供試的2個品種試驗結果來看，暗培養天數在20～40d，增殖系數已達到4.14～6.01倍的較高水平，所以選擇暗培養天數為20～40d是較合適的。考慮到蝴蝶蘭組培苗的繼代周期一般為50～60d，如果暗培養的天數達到50d和60d時，新萌發的芽體較為嫩綠，雖然增殖的新芽多，但沒有經過光照培養，芽體較小，相對較弱，有的甚至出現玻璃化，在下一次繼代轉瓶初期又再一次進行暗培養，長時間處于暗培養至第2次繼代轉瓶時不排除會出現黃化或死芽情況，不利于正常增殖生長。所以，在本試驗中不將增殖率較高的暗培養天數50d和60d列為合適處理方法。在1個繼代周期內，適當增加暗培養的天數，明顯有利于提高叢生芽增殖率。

影響蝴蝶蘭組織快速繁殖的因素有很多，包括蝴蝶蘭品種的不同、基礎培養基的選擇、外植體不同、消毒方式不同、調節物質及添加量的不同、還有光照條件、溫度、濕度等培養條件的不同等。本文為暗培養時間對蝴蝶蘭叢生芽增殖影響的初步探索，旨在為蝴蝶蘭品種擴繁增殖階段科學暗培養提供參考，具體應用指導生產還有待進一步深入探索。此次試驗僅針對特定品種“汕農幸運女神”“汕農福星”所得出的結論，而不同蝴蝶蘭之間存在品種差異，對培養基和培養條件的要求也不同，具體品種的合適暗培養時間有待進一步探索；在設置暗培養時間上，本文以10d為間距，如縮短為5d間距，進一步觀察暗培養時間對蝴蝶蘭叢生芽的影響，更有利于準確掌握不同品種的適宜暗培養時間；此次試驗僅在單一個繼代周期內進行，對其后續多代轉瓶情況仍未了解，連續幾個繼代周期(3代以上)進行試驗，并觀察對其以后生長如促根或移栽階段的影響，才能科學總結具體品種的暗培養需求；暗培養與褐變的關系。褐變現象是指在組織培養過程中，培養材料向培養基中釋放褐色物質，致使培養基逐漸變成褐色，培養材料也慢慢變褐而死亡的現象培養。外植體褐變是植物組織培養中遇到的重要問題。與褐變的相關研究表明，光照強度與褐變程度之間存在一定關系。如，許傳俊等通過培養基及光照對蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響試驗結果表明，光照強度增加，外植體褐變也嚴重[12]；趙伶俐等研究了不同光照強度培養下，蝴蝶蘭初代培養過程中外體內多酚氧化酶(PPO)活性、總酚含量以及褐化百分率的變化規律[13]，也表明了光照強度與褐化程度之間的關系。那么，如何通過科學的暗培養減輕褐化程度有待于進一步深入探討研究，科學總結研究結果。

暗培養時間與蝴蝶蘭叢生芽增殖關系，此次試驗僅為初探，受品種、培養基、培養條件等相關條件所限制，未能進一步全面探究，對于暗培養時間對蝴蝶蘭叢生芽的影響將有待進一步探索研究，為現有的蝴蝶蘭快速繁殖體系添磚加瓦，降低組培成本，以提高經濟效益。