蝦脊蘭種子的組織培養技術

張玲 趙穎 葉波 高浩杰 孫圳

(舟山市林業科學研究院，浙江 舟山 316000)

野生植物是自然生態系統中的重要組成部分，是維持生物多樣性的重要保障，是不可或缺的生物資源，一些野生植物的生存受到嚴重威脅，部分種類甚至滅絕由于人類的干擾活動不斷加劇和全球氣候變化。生物多樣性是人類賴以生存和發展的基礎。所以，保護野生植物及其賴以生存的自然環境是人類自身生存和發展的必要措施，亟需拯救瀕臨滅絕的物種。

蝦脊蘭(Calanthe discolor Lindl.)屬蘭科(Orchidaceae)蝦脊蘭屬(Calanthe)多年生地生植物，《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》把蘭科植物全科所有種類列入保護范圍，是世界性瀕危物種。在舟山主要分布在舟山島、桃花島、朱家尖島、普陀山等島嶼，生于闊葉林下或灌叢中。蝦脊蘭既是觀賞植物中的珍品，也有較高的醫藥用途，在開發利用上具有很高的價值。由于人為采挖和生境破壞，野生資源瀕臨枯竭，亟需加強擴繁保護。

目前，對受到威脅或已經瀕危的中國野生植物，采取就地保護與遷地保護相結合的方法。野生植物保護區建設就是就地保護重點，野生植物在生態系統內進行恢復和擴繁需要受威脅植物的保護盡量結合其生境。將植物的種質資源保存在植物園就是遷地保護，建立種子庫、基因庫和相關研究機構的實驗基地和實驗室中保存。就地保護和遷地保護都是野生植物保護的基本措施。

21世紀人類面臨的共同主題是維護生態安全，加強生態保護，促進生態文明。隨著社會經濟的發展，生態環境建設已經越來越受到各級政府和有關部門的重視。加強野生植物物種保護，特別是珍稀植物的保護和利用，是維護生態平衡，保障生態安全，實現生態文明的重要舉措。適應海島生境的蝦脊蘭不僅具有較高的園藝價值，而且在海島生態中占有重要的地位，對其而進行保護和利用具有重要的現實意義，而保護的基礎是種群數量，因此組培快繁是前提。

1 材料與方法

1.1 蝦脊蘭生物學、生態學特性

在舟山市朱家尖、桃花島等地根據蝦脊蘭分布點的實際地形地勢，采用樣方法對蝦脊蘭所在群落進行群落特性調查。選擇10m×10m的樣方，統計每個樣方內蝦脊蘭的數量、群落郁閉度、伴生植物、小地形等情況，分析蝦脊蘭所在群落的物種組成與結構等生態學特性。

1.2 試驗材料的采集

8—9月于舟山朱家尖和桃花島采集蝦脊蘭成熟未開裂的蒴果，用干凈真空袋裝好帶回實驗室放于3℃冰箱中冷藏備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒴果消毒

取成熟未開裂的蝦脊蘭蒴果洗凈并吸干水分，有斑點的蒴果用手術刀輕輕刮掉，用75%酒精棉球擦拭多次后在超凈工作臺上風干表面水分，用無菌鑷子和無菌手術刀將小種子在1個自制的小容器里挑選處理，容器上開口，下小細網，見圖1，用鑷子夾住容器用蒸餾水沖洗3～5次，用75%酒精浸泡30s。

圖1 自制容器

種子酒精浸泡完成后用無菌水沖洗3～5次。把放有種子的容器放入1個無菌瓶中，并放入2%的次氯酸鈉浸泡10min。消毒殺菌完畢再用無菌水反復沖洗3～5次。把容器放入無菌瓶內反復沖洗，無菌水瀝干凈備用。

1.3.2 種子誘導

前期試驗根據前人研究表明，蝦脊蘭種子誘導以4/5MS、1/2MS及MS培養基，分別加入200ml·L-1椰汁、不同激素(0.025～0.1mg·L-16-BA，0.1mg·L-1NAA)和0.1g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖20g·L-1，pH值5.7，光照強度35μmL·m-2，光照時長12h，培養室溫度控制在25±2℃，觀察種子萌發情況。

萌發率(%)=誘導成功瓶數/接種瓶數×100

1.3.3 增殖與分化

將蝦脊蘭誘導原球莖接種在MS、1/2MS培養基上，分別加入100ml·L-1椰汁或者15g·L-1香蕉泥，添加不同激素配比(0.5～1mg·L-16-BA，0.25mg·L-1NAA)和0.25g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培養室溫度控制在25±2℃，光照強度40μmL·m-2，光照時長為12h，35d后統計結果。

增殖數=增殖的原球莖數/接種原球莖數

1.3.4 生根與壯苗

在蝦脊蘭培養瓶中選擇長勢良好且株高3cm以上蝦脊蘭進行生根試驗。以MS培養基為基礎，分別加入100ml·L-1椰汁或者20g·L-1香蕉泥，添加不同激素(0.25mg·L-1NAA)和0.5g·L-1AC組合，并附加瓊脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培養室溫度控制在25±2℃，光照強度40μmL·m-2，光照時長為12h，在90d后觀察生根情況。

生根率(%)=(生根數/接種數)×100

2 結果與分析

2.1 種子誘導

蝦脊蘭種子萌發以激素濃度適宜在加了椰汁的培養基中，萌發效果較好，時間短，具體見表1，即在培養基A4：4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC，培養約120d后種子開始從乳白色小點轉化為黃色，繼續培養約30d左右以后，蝦脊蘭原球莖逐漸發育成淡綠色，超過85%萌發率，原球莖長勢旺盛飽滿，見圖2。當6-BA濃度為0.1mg·L-1且不加椰汁的誘導率小于10%，并且出現較高比例的褐化現象。

表1 不同激素和有機組合誘導蝦脊蘭種子結果

圖2 蝦脊蘭種子誘導

2.2 原球莖的增殖與分化

將蝦脊蘭原球莖轉接至不同激素和天然復合物的組合中，天然的香蕉或者椰汁對細胞和組織的增殖分化起到明顯的作用，見圖3。原球莖在B3培養基中增殖速度較快，30d后即可形成蝦脊蘭小苗，具體見表2。當6-BA濃度較高時(1mg·L-1)，蝦脊蘭增殖系數較低，并出現褐化現象。

表2 不同培養基對蝦脊蘭原球莖增殖的影響

圖3 蝦脊蘭原球莖增殖

2.3 蝦脊蘭生根

蝦脊蘭分化后的小苗接種到生根培養基中14d左右，小苗開始生根。半透明狀接近白色的新根慢慢的顏色變深變成深綠色，后逐漸變長變粗，見圖4。在未添加任何激素的C1培養基上，蝦脊蘭也有很高的生根率；添加了NAA結合香蕉泥或椰汁的培養基中生根效果更好可達100%，且粗壯、較長、植株健壯，具體見表3。

表3 不同培養基對蝦脊蘭生根的影響

圖4 蝦脊蘭生根苗

2.4 煉苗和移栽

根據蝦脊蘭生物學特性和組培苗生長情況，當組培苗長至8cm，具2～4片葉且根系完整時即可移栽，進行閉瓶和開瓶馴化約10d左右。移栽前先將組培瓶閉口放至于溫室中煉苗，讓瓶內的苗逐漸適應室內環境，慢慢打開組培瓶，之后將蝦脊蘭組培苗取出來，先用自然水洗干凈培養基凝膠，再用1000倍多菌靈水溶液浸苗8～15min，取出晾干后待種。進行盆栽試驗1180株，基質選用等體積比的椰糠和河沙的混合基質，澆足定根水。管護中保持21℃以上溫度，置于陰涼通風處栽培，在此期間不澆水，以利新根生長和防止病害發生，5周后移入室中栽培。栽種時要注意保濕和遮蔭，成活后可適當追肥，移栽后需要柔光，注意植株保濕，成活率在90%以上。新葉和新根長出后可以按照常規蘭花進行種苗管理。

3 討論

根據王國明《舟山海島種子植物》，通過海島植物調查蝦脊蘭的生境，為蝦脊蘭組培試驗提供了基礎。培養基的成功優選參考曾宋君等對銀帶蝦脊蘭進行種子離體培養。采用蝦脊蘭種子，原球莖，完整植株途徑的方法篩選出適宜的培養基，建立無菌播種快繁技術體系參考于羅遠華等以三褶蝦脊蘭種子為外植體。胚柄細胞與內珠被緊密接觸為其提供營養物質；而種子萌發困難的主要原因是內種皮營養物質和水分的運輸在一定程度上的阻隔，連靜靜等發現，無距蝦脊蘭幼胚的發育過程屬于石竹型提供了很好的借鑒。

蘭花種子的萌發率與其種類和成熟度均有緊密關系，蝦脊蘭的種子極小，在自然條件下萌發率不超過10%。通過蒴果培養可以有效提高蝦脊蘭的快速繁殖，1個蒴果內含有種子多至數十萬粒。目前，蝦脊蘭常采用塊莖進行分株繁殖，但該種方法成活率較低。因此，運用種子無菌萌發與組培快繁技術對蝦脊蘭進行擴繁，同時通過蝦脊蘭遷地保護與回歸等方式進行保護，緩解蝦脊蘭生存狀況，以期為今后海島珍稀植物保護等研究工作提供經驗與幫助。

目前，組培技術很廣泛地應用在蘭科植物的生產和繁育上，如風蘭、蝴蝶蘭、大花蕙蘭等蘭花品種的組培技術已經非常成熟。蝦脊蘭采用成熟未破裂的種子為外植體進行組織培養，不僅能減少褐化，還易滅菌。6-BA和NAA的不同濃度組合對蘭科植物種子萌發具有顯著影響。本研究結果發現，在培養基中加入椰汁和降低瓊脂的含量能有效提高種子的萌發、原球莖的增殖和分化、生根。因此，通過有機成分、激素、控制礦物質元素等條件，能給植物提供所需的生長營養成分。

4 結論

根據各樣地調查，得知蝦脊蘭所在群落的物種組成與結構等生態學特性。蝦脊蘭，是蘭科蝦脊蘭屬植物。地生植物，高30～40cm，莖不明顯。葉近基生，2～3枚，葉片狹倒卵狀長圓形，先端急尖或鈍而具短尖，基部楔形下延。花葶從當年新株的幼葉叢中長出，總狀花序長5～15cm，有花數朵至10余朵；花紫紅色開展；萼片近等長，中萼片卵狀橢圓形，側萼片狹卵狀橢圓形；花瓣萼片較小，倒卵狀匙形或倒卵狀披針形，唇瓣玫瑰色或白色，與萼片近等長，與蕊柱合生，3裂，側裂片斧狀，中裂片卵狀楔形，先端2裂，唇盤上具3條褶片；距圓筒形，細長，末端彎曲；蕊柱粗短。蒴果長圓柱形，下垂。花期一般在4—5月，果期8—10月。根狀莖不是很明顯，假鱗莖粗短，近圓錐形；耐半陰，較耐寒，不耐干旱，喜陽光充足溫暖濕潤的環境，喜疏松肥沃和排水良好的腐葉土或泥炭苔蘚土，常生于海拔780～1500m的常綠闊葉林下。生于山坡林下，灌叢中，其周邊具有代表性的喬木為紅楠、柘樹、普陀樟等；灌木為茶、朱砂根、天仙果等；草本植物為山蒟、絡石、江南星蕨等。了解了蝦脊蘭的生物學和生態學特性給接下來對蝦脊蘭組培試驗打下了基礎。

本研究篩選得到蝦脊蘭種子萌發培養基，根據不同激素配比和有機添加物的組合，在蝦脊蘭誘導階段，4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖20g·L-1，蝦脊蘭誘導率達到85%以上。在蝦脊蘭增殖分化階段，MS加100mL·L-1椰汁加0.5mg·L-16-BA加0.25mg·L-1NAA加0.25mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1增殖最快。在蝦脊蘭生根階段，MS加100mL·L-1椰汁加0.25mg·L-1NAA加0.5mg·L-1AC加瓊脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1培養基中生根效果更好，可達100%，且粗壯，較長，植株健壯。培養條件為pH5.8，溫度25±2℃，光照時長12h。從此試驗得出，在每個階段添加椰汁能有效提高蝦脊蘭的種子萌發，原球莖增殖分化和壯苗生根。根據蝦脊蘭原生地生境狀況，選擇生境相似的地點，模擬蝦脊蘭自然生長條件，運用遷地保護技術對蝦脊蘭進行保護，并結合就地保護、近地保護技術，選擇原生地或近生地，對蝦脊蘭進行回歸，調查與監測各保護地蝦脊蘭植株的存活和生長狀況，制訂保護措施。