衡水湖濕地荷花公園土壤細菌古菌多樣性研究

李 輝

(衡水學院濕地保護與研究中心，河北 衡水 053000)

衡水湖坐落于河北省衡水地區境內，位于京津冀的生態敏感地帶，在防澇防旱、調節氣候、維護環境生態安全和保護生物多樣性等方面發揮著重要的作用[1]。同時，衡水湖是華北內陸地區唯一保持水域、沼澤、灘涂、草甸和林地等完整的內陸濕地生態系統，現有湖泊面積75km2，蓄水能力達到1.88億m3[2]。衡水湖是聯結印度洋、南亞大陸、東亞和西伯利亞生物多樣性的中心點，是北溫帶野生動物的聚集地，其獨特的水文、土壤和氣候孕育了復雜且完善的動植物群落，衡水湖位于“東亞-澳大利西亞”遷徙路線的中心部位，是數百萬只候鳥重要的停歇地、中轉站和密集交匯區[3]。衡水湖蘊藏著巨大的生態效益、社會效益、經濟效益[4]。

微生物參與濕地生態系統的物質循環和能量流動，是濕地生態系統的重要組成成分[5]。微生物的代謝不僅改變濕地土壤的理化性質，而且能夠在降解有機質，產生和傳遞能量，促進地球元素循環等方面起著非常重要的作用[6]。濕地微生物多樣性的高低直接決定著濕地生態系統的穩定性[7]。近年來，國內對天然濕地土壤微生物的研究較多，而對人工濕地，尤其是針對衡水湖國家級自然保護區有關微生物多樣性的研究幾乎沒有。本文選取衡水湖濕地國家自然保護區中荷花公園區域的土壤為研究對象，采集不同位點的土樣，采用高通量測序的研究方法，通過對濕地土壤細菌群落多樣性進行分析，旨在揭示衡水湖濕地荷花公園區域土壤細菌群落的多樣性，為今后衡水湖濕地土壤微生物的合理開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2020年10月圍繞衡水湖濕地荷花公園選取5個采樣點，在各個采樣點分別采集表層0～5cm和5～10cm的土樣，每個采樣點取4個平行樣并混合均勻，將混合均勻的樣品裝入滅過菌的自封袋內并盡快運回實驗室，置于-80℃冰箱保存。

1.2 衡水湖濕地荷花公園土壤微生物組成多樣性測序

采用FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美國)總DNA提取試劑盒，對采集的樣品進行總DNA提取。利用PCR擴增細菌古菌16S rRNA基因V3-V4區域，擴增引物 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)；PCR擴增體系95℃ 3min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 45s，30次循環；72℃ 10min。高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司在Miseq PE300/NovaSeq PE 250平臺進行測序完成。所得的測序數據通過Excel和R語言以及美吉云平臺進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 衡水湖濕地荷花公園5個土壤樣品的物種分類學分析

本研究共5個樣品，對其細菌16S rRNA基因測序共獲得226103對reads，對所得序列進行OTU劃分，共得出4359個OTU，再對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，5個樣品中共得出2個Domain，2個Kingdom，60個Phylum，166個Class，371個Order，623個Family，1105個Genus，1886個Species。由表1可知，5個樣品中發現的OUT數分別為1683個、3132個、2171個、2765個和1297個。5個樣品中a2和a5發現的物種數較多，分別為1325個和1316個，a3和a1物種數相對少些，分別為1093個和1001個，a7樣本中的物種數最少，為866個。由此可見，5個樣品土壤中物種分類學上存在明顯差異，這說明衡水湖荷花公園土壤的微生物多樣性比較高。

表1 不同土壤樣品的物種分類學分析

2.2 衡水湖濕地荷花公園5個土壤樣品稀釋曲線分析Alpha多樣性分析

利用MiSeq平臺對采集的5個樣品進行高通量測序，5個樣品的覆蓋率均在97%以上，見表2，且每個樣品的稀釋曲線基本上接近飽和，見圖1，表明測序深度基本達到飽和，說明當前測序量下能夠真實地反映樣品土壤細菌古菌的alpha多樣性。由表2可知，a2樣品的sobs指數、ace指數、bootstrap指數和chao指數均高于其他4個樣品，這表明a2樣品土壤中細菌古菌群落豐富；shannon指數值越大，微生物群落多樣性越高，simpson指數值越小，微生物群落多樣性越高，a2樣品shannon指數值最大，simpson指數值最小，pd指數最大，表明該樣品土壤中細菌古菌群落多樣性高于其他4個樣品；shannoneven指數和simpsoneven指數反映微生物群落的均勻度，a2樣品和a5樣品中細菌古菌群落的均勻度明顯高于其他3個樣品。

表2 不同土壤樣品Alpha多樣性分析

圖1 不同土壤樣品稀釋曲線分析

2.3 衡水湖濕地荷花公園5個土壤樣品細菌古菌群落heatmap圖

將衡水湖濕地荷花公園不同土壤樣品進行數據庫比對，并分析不同分類水平上的細菌古菌群落結構組成。在門水平上，選取總豐度前50的物種繪制heatmap圖，見圖2，由圖2可知，衡水湖濕地荷花公園土壤中細菌古菌群落結構在門分類水平上具有較高的多樣性，不同樣品之間細菌古菌組成差異不大，但相對豐度差異很大。優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)18%～35%、放線菌門(Actinobacteriota)6%～21%、擬桿菌門(Bacteroidota)3%～18%、綠彎菌門(Chloroflexi)4%～18%、厚壁菌門(Firmicutes)1%～7%、浮霉菌門(Planctomycetota)1%～13%、酸桿菌門(Acidobacteriota)4%～9%、疣微菌門(Verrucomicrobiota)1%～6%、泉古菌門(Crenarchaeota)2%～5%、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)1%～7%等[8，9]。在大多數的濕地土壤樣品中，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和綠彎菌門等為優勢菌門[10]。有研究表明，變形菌門中含有多種反硝化細菌，可進行自養和異樣；對土壤中的含氮物質的循環起著主要作用[11，12]。據報道，Chloroflexi種類形態多樣，營養方式和代謝途徑十分豐富，可存活于多種環境中，并且其多數種類參與了C、N、S等一系列重要元素的生物地球化學循環過程[13]。在a2、a3和a5樣品土壤中，Chloroflexi相對豐度在11%～19%以上，而在a1和a7樣品土壤中，Chloroflexi相對豐度在4%～6%，造成這種差距的原因，可能是由于a1和a7采樣點是近水邊裸露的土壤，而a2、a3和a5采樣點是水邊覆蓋著植物殘渣的黑色土壤。由此可見，Chloroflexi的物種豐度可能與衡水湖濕地荷花公園的周邊環境有關，從而成為衡水湖濕地荷花公園土壤中的第四大優勢菌門。有報道稱，酸桿菌門是重要的根際細菌[14]。在a2、a3和a5樣品土壤中，Acidobacteriota相對豐度在4%～10%，而在a1和a7樣品土壤中，Acidobacteriota相對豐度均低于1%，這可能是因為a2、a3和a5采樣點均有植被覆蓋。

注：橫坐標為樣本名(或分組名)，縱坐標為物種名，通過色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的豐度變化情況，圖中右側為顏色梯度代表的數值。

3 結論

本研究共檢測出60個門166綱371目623科1105屬1886種，共計4359個OUT。由alpha多樣性可知，a2樣品土壤中細菌古菌群落的豐富度和多樣性高于其它4個樣品，a2和a5樣品土壤中細菌古菌群落的均勻度明顯高于其它3個樣品。衡水湖濕地荷花公園土壤中細菌古菌群落結構在門水平上相差不大，但物種相對豐度差異大。衡水湖濕地荷花公園土壤的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)18%～35%、放線菌門(Actinobacteriota)6%～21%、擬桿菌門(Bacteroidota)3%～18%、綠彎菌門(Chloroflexi)4%～18%等。