基于生物信息技術研究陳士鐸治療不孕的用藥規律與作用機制

石權芳

何有中中醫門診部,廣東省廣州市 510091

陳士鐸,字敬之,號遠公,浙江山陰(今浙江紹興)人,約生于明天啟年間,卒于清康熙年間[1]。陳士鐸著作頗多,上精岐黃,下通百家,學術思想鮮明,尊古旨而創新法,臨床多運用五行理論闡釋病機所在以及處方用藥,對于不孕的認識另辟蹊徑,獨樹一幟,故本研究就在于整理陳士鐸治療不孕醫案的理論以及處方規律,旨在探討陳士鐸治療不孕疾病學術思想、處方用藥規律以及運用現代的網絡藥理學手段闡釋物質基礎機制,以饗同道。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究選自《陳士鐸醫學全書》[2]中有關不孕治驗的記載,最終納入20首方劑和50味中藥。

1.2 數據整理 中藥名稱、分類等參照《中華人民共和國藥典:2015年版》[3]和《中藥學》[4]進行規范。譬如“金釵石斛”統一為“石斛”,“破故紙”統一為“補骨脂”,“甘菊花”統一為“菊花”等。

1.3 統計學方法 將不孕醫案的藥物按標準錄入 Microsoft Excel,建立“《陳士鐸醫學全書》治療不孕疾病用藥數據庫”,所有數據均雙人負責審核,確保數據無誤;應用SPSS 25.0聚類分析,聚類方法采用質心聚類,度量標準區間采用 Pearson 相關性度量,應用SPSS Modeler 14.1 Apriori進行藥物關聯分析,支持度>20%,置信度>80%。生物學機制通過中醫藥整合藥理學研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine, TCMIP) v2.0分析。

2 結果

2.1 藥物頻次 總結《陳士鐸醫學全書》中的所有關于不孕的相關醫案,排除重復醫案以及方藥,總計納入20首方劑、50味中藥,總計用藥151頻次,頻次≥3的中藥有20味,其貢獻度為75.50%。治療不孕中藥中使用頻次位居前10 的分別是白術、人參、茯苓、巴戟天、肉桂、當歸、杜仲、熟地、山藥、白芍,見表1。

表1 陳士鐸治療不孕高頻中藥及頻率

2.2 藥物的氣味歸經分布 對治療不孕疾病的所有藥物進行氣味歸經的分布統計分析,結果顯示四氣以“溫”為主;五味以“甘”為主;歸經以“脾”為主,依次是脾(87頻次)、腎(74頻次)、肺(52頻次)、肝(50頻次)、胃(44頻次)、心(38頻次)、大腸(5頻次)、三焦(3頻次)、膽(3頻次)、心包(2頻次)。

2.3 聚類分析 聚類分析結果顯示,可將治療不孕的藥物分為14組,見表2。

表2 陳士鐸治療不孕藥物聚類分析結果

2.4 關聯規則分析 關聯規則分析顯示,對藥有8組,涉及8味中藥,山茱萸、熟地黃、白術、肉桂、巴戟天、人參、茯苓、杜仲。角藥有6組,涉及5味中藥,白術、肉桂、巴戟天、茯苓、人參,見表3。

表3 藥物之間的關聯規則分析

2.5 中藥網絡調控機制挖掘結果 本研究將關聯規則支持度、置信度最高的角藥(人參—巴戟天—白術)進行物質基礎研究,通過TCMIP v2.0中的“中醫藥關聯網絡挖掘”模塊的藥物選擇“人參—巴戟天—白術”,疾病選擇“female infertility”進行生物分子機制研究。中藥網絡調控機制挖掘結果共計195個節點,包括CYP19A1、ESR1、ESR2。核心網絡靶標及其拓撲特征值共計198個,見表4。

表4 核心網絡靶標及其拓撲特征值列表

2.6 GO分析與KEGG分析 基于TCMIPv2.0對“人參—巴戟天—白術”與不孕進行GO分析和KEGG分析。GO-生物過程前10的包括氧化還原過程、乙醇氧化、細胞醛代謝過程、電子傳遞鏈、輔因子代謝過程、碳水化合物代謝過程、對毛喉素的細胞反應、草酰乙酸代謝過程、cAMP 生物合成過程、脂肪酸代謝過程;GO-細胞成分前10 的包括線粒體基質、線粒體、髓鞘、線粒體內膜、胞質溶膠、含蛋白質復合物、膜筏、核質、線粒體膜;GO-分子功能前10的包括醛脫氫酶 (NAD) 活性、氧化還原酶活性、氧化還原酶活性,作用于供體的醛或氧代基團,NAD 或 NADP 作為受體、3-磷酸甘油醛脫氫酶 (NAD+)(非磷酸化)活性、NAD綁定、3-氯烯丙醛脫氫酶活性、一氧化氮合酶調節活性、3-羥酰基輔酶A脫氫酶活性、電子轉移活性、腺苷酸環化酶活性。

反應組通路前10的包括乙醇氧化、PKA激活、辛酰輔酶A的β氧化為己酰輔酶A、癸酰輔酶Aβ氧化為辛酰輔酶A-CoA、呼吸電子傳輸、RA生物合成途徑、腺苷酸環化酶激活途徑、四氫生物蝶呤 (BH4) 的合成、回收、回收和調節、eNOS 激活、腺苷酸環化酶抑制途徑。

2.7 藥物—成分—靶標—通路分析 基于TCMIP v2.0對“人參—巴戟天—白術”與不孕進行構建自定義多維關聯網絡可視化圖。3味中藥,53個有效化學成分,51個核心靶標,14條通路發揮治療不孕的藥理作用,見表5。

表5 排名前14的信號通路

3 討論

本研究基于《陳士鐸醫學全書》的不孕醫案進行用藥規律分析,共計納入20首方劑和50味中藥。高頻使用的藥物以補氣、溫陽、補腎為主,中醫證候特征分析不孕多以腎虛血瘀、腎氣不足多見[5]。陳士鐸認為,后天資助先天,只有脾胃健運才能補益腎水。目前臨床多認為不孕癥宜從腎虛血瘀入手,但療效差強人意,呂春英指出,臨床使用健脾益氣、健脾溫陽、健脾養陰之法,重視脾的作用,往往會有意想不到的療效,但仍然要尊重中醫辨證原則[6]。陳士鐸注重五行理論的運用,水侮土,往往會出現中焦失運,中焦脾胃受損則水谷精微不能輸布,導致五臟虧虛,腎臟更加失職,因此治療之時以健脾制水,人參、白術、茯苓取四君子湯之意,巴戟天、肉桂溫補腎陽,當歸、白芍、山藥補虛,熟地、杜仲益腎。本研究的四氣五味歸經以“溫”“甘”“脾”為主,結果也同樣支持重視脾的治療原則,溫中健脾,甘溫補后天以資先天。

陳士鐸重視先天與后天的關系,同時也注重辨證原則。聚類分析結果將藥物分為14類,除了溫陽、健脾、補腎之外,有行氣、清熱、滋陰、祛濕等治法。中醫素有女子以肝為先天之說,肝藏血、主疏泄瀉影響著生殖機能,陳士鐸指出,“血藏肝中,精涵腎內,若肝氣不開,則精不能泄?！蓖瑫r陳士鐸認為濕邪的產生并非外邪,而是責之于脾土。陳士鐸治療選用補中益氣湯,而非祛濕化痰消克之藥,陳氏認為,“提脾氣而升于上,則水濕反利于下行,助胃氣而消于下,則痰涎轉易于上化?！薄瓣枤馔?自足以攝精;邪濕散,自可以受。”備孕之人不可用攻伐之品損害正氣,運用補中益氣湯以升為降的臨床思維值得我們借鑒。

對藥、角藥是運用中醫理論的一種配伍方式,藥少而專,配伍的目的有相互協助而增強藥力、相互制約而展其長、 兩藥合用而另生新用、兩藥合用有溝通導引作用[7-8]。熟地黃配伍山茱萸以補腎填精,陳士鐸在《本草新編》[8]中指出,“蓋腎水非得酸不能生,山茱萸味酸而性又溫,佐熟地實有水乳之合。然而山茱萸味過于酸,非得熟地之甘溫,山茱萸亦不能獨生腎水也。配合相宜,如夫婦之好合,以成既濟之功也?！卑仔g利腰臍之濕,與肉桂、巴戟天、杜仲配伍,補瀉相合,腰臍之氣既利,而腎中之濕氣既除,此時方可補益。陳士鐸認為人參為補氣健脾之圣藥,人參氣味陽多于陰,少用則泛上,多用則沉下,人參與肉桂、巴戟天配伍溫補腎陽,人參與白術、茯苓配伍健脾以制水。陳士鐸在《本草新編》[8]中指出,“蓋人參乃君藥,宜同諸藥共用,始易成功……如健脾也,必加茯苓、白術……用之補則補,用之攻則攻,視乎配合得宜,輕重得法耳?！?/p>

家族19亞家族A成員1 (CYP19A1)基因編碼的酶是細胞色素P450超家族的成員,CYP19A1基因編碼的芳香酶是催化雌激素生物合成過程中雄烯二酮和睪酮對雌酮和雌二醇的芳構化的最終和限速步驟的主要酶[9]。CYP19A1蛋白質存在于內質網, 在雌激素生物合成中起著催化作用。CYP19A1在婦科疾病中的作用已經備受關注,一項臨床研究顯示,55名多囊卵巢綜合征(PCOS)患者與55名未患 PCOS 的女性相比,患有 PCOS 的女性芳香化酶mRNA的相對表達較低(P<0.05)。 PCOS組CYP19A1(芳香酶)mRNA的相對表達為0.38±0.25,而非PCOS組為1.00±0.00[10]。也有直接證據指向CYP19A1與不孕密切相關,一項薈萃研究顯示,雌激素受體2(ESR2)和CYP19A1基因可能是子宮內膜異位癥相關不孕的潛在危險因素[11]。本研究顯示,疾病—藥物關聯的節點包括CYP19A1、ESR1、ESR2,因此我們推測角藥“人參—巴戟天—白術”是通過調控CYP19A1、ESR1、ESR2來發揮作用。

本研究運用生物信息技術對陳士鐸治療不孕的用藥規律和物質基礎進行研究,從宏觀和微觀兩個層面為科研和臨床提供了依據;雖然采用整合技術手段,但仍然存在諸多不足,不能全面展現中醫的整體思維和辨證論治特色,需要結合臨床實際互相彌補。