精液異常患者短時兩次取精精液質量差異性分析*

彭 潔 戚青林 趙元章 王 晶

江西省萍鄉市婦幼保健院生殖健康科 337000

據統計,我國不孕不育夫婦占比為10%～15%,而其中約有30%是由男性因素所導致,隨著試管嬰兒技術的不斷推廣,越來越多的不孕不育患者采用該方法進行懷孕,但男性精子問題造成的受精障礙、胚胎質量差的情況日益增多[1]。如果男方在取卵日由于緊張或操作不當等各種因素影響,極易發生取精杯掉地、精液外射等情況,導致精液中的精子數量或質量不足,從而難以滿足體外受精的需求[2]。有研究指出[3],對于精液異常的患者,在其第一次射精后對其精液標本進行連續采集可以獲得更高質量的精液標本。不同禁欲時間會在一定程度上影響精液的質量,性交頻繁會降低精液數量,而性交頻率過長又會降低精子活力,因此,精液異常患者需掌握好性交頻率,確定合理的禁欲時間,便可有效提高受孕率。基于此,本文對精液異常患者短時(24h內)兩次取精精液質量的差異性進行分析,通過比對兩次精液標本精液常規分析(精子濃度、總數、活動力)、精子畸形率以及精子DNA碎片率來評估精液質量差異,對短時禁欲是否能提高患者精子質量進行評估,以為試管嬰兒技術的開展提供參考,具體內容如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1—8月來我科檢查的32例弱精癥患者為觀察對象,年齡26～42歲,平均年齡(32.50±3.70)歲。所有患者經精液常規分析后發現,精子總活力<40%或前向運動百分率<32%。所有患者均對本次研究的目的、意義、風險等有所了解,并表示自愿參與研究,已簽署知情同意書,本次研究獲得我院倫理委員會審批通過。

1.2 方法 收集32例患者兩次精液標本進行檢測,其中第一次取精時間為禁欲2～7d,視為正常禁欲組;第二次取精時間為24h內,視為短時禁欲組。對兩組精液進行常規分析及精子畸形率、精子DNA碎片率的檢測。

1.2.1 精液常規分析:精液常規分析采用北昂精液分析儀進行,在精液液化后不久立即開始分析,將液化標本在原容器內充分混勻,并禁止劇烈振動,提前將Makler 計數板放置在恒溫臺上預熱;然后將液化的10μl精液滴在清潔的計數板精液池上,覆上專用蓋玻片,將其固定在顯微鏡恒溫載物臺上,調節顯微鏡,直至界面可以清晰地看到精子或雜質,通過微調將精子調黑,以便軟件能夠將其捕捉;進行圖像處理時,對所捕獲圖像序列進行步距調節,令視野中的精子都能被捕捉上,將被選入的雜質數目填入指定位置后點擊“計算參數”“保存檢驗項目”,切換視野,對精子總數進行重復計算,直至其達到200個以上,保存并打印。

1.2.2 精子畸形率:使用世界衛生組織推薦的金標準巴氏染色法進行檢測,先取5～10μl的精液滴在載玻片的一端,并立即用第二張載玻片的非磨砂端以45°角沿第一張載玻片的表面移動并接觸精液滴,沿載玻片的長軸緩慢拖回拉片,制成一張涂片;重復取樣前,再次混勻精液標本,按照上述步驟制作另外一張涂片;涂片經空氣干燥后,按巴氏染色步驟將其浸入乙醇溶液中,自然晾干后用顯微鏡觀察精子形態,每個重復樣本評估200個精子,以達到可接受的低取樣誤差。

1.2.3 精子DNA碎片率:采用安徽安科生物工程股份有限公司的精子DNA碎片染色試劑盒進行檢測,采用生理鹽水將精液標本濃度調整至500～1 000萬/ml;溶液A在90～100℃環境中溶解5min,并于37℃恒溫箱內保存5min,隨后加入30μl精液并混勻;將20μl瓊脂糖精液加入玻片上,蓋上蓋玻片,置于4℃冰箱內保存5min,然后分別加入溶液B、C,并采用溶液D、E染色,重復混勻后用自來水沖洗10s,自然晾干后使用400倍鏡對500個精子涂片形態進行觀察。

1.3 觀察指標 (1)精液常規分析中的觀察指標:精液量、總活力、前向運動力、精子濃度、精子總數等。(2)精子畸形率[4]:計算重復玻片正常形態精子百分率的平均值和差異,若兩個百分率之間的差異是可接受的,報告正常形態精子的平均百分率;若差異太大,重復兩次精液取樣制備兩張新鮮玻片,再次評估玻片,以最接近的整數報告正常形態精子的平均百分率。正常形態率≥4%為正常,正常形態率<4%為異常,比較精子形態正常和異常患者中不同禁欲時間的精子質量。(3)精子DNA碎片率[5]:沒有碎片的精子呈大暈環、中暈環,有碎片的精子呈小暈環、沒暈環。精子DNA碎片率<15%為正常,精子DNA碎片率≥15%為異常,比較精子DNA碎片率正常和異常患者中不同禁欲時間的精子質量。

2 結果

2.1 兩組精液質量比較 短時禁欲組精液量、精子總數、DNA碎片率低于正常禁欲組,精子總活力、前向運動力、正常形態率高于正常禁欲組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組精液質量比較

2.2 根據精子正常形態率分組患者不同禁欲時間精液質量比較 精子形態正常患者中不同禁欲時間的精子正常形態率無統計學差異(P>0.05);精子形態異常患者中,短時禁欲組的精子正常形態率高于正常禁欲組,且差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 根據精子正常形態率分組患者不同禁欲時間精液質量比較

2.3 根據精子DNA碎片率分組患者不同禁欲時間精液質量比較 精子DNA碎片率正常患者中不同禁欲時間的精子DNA碎片率無統計學差異(P>0.05);精子DNA碎片率異常患者中,短時禁欲組精子DNA碎片率低于正常禁欲組,且差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 根據精子DNA碎片率分組患者不同禁欲時間精液質量比較

3 討論

輔助生殖治療取卵日精液質量的好壞會對試管嬰兒技術的結局產生直接影響,有研究發現,射精頻率會影響精液標本參數,因此世界衛生組織指南中建議不孕癥患者在接受輔助生殖治療時應在行常規精液檢查前禁欲2～7d,禁欲時間長短會在一定程度上影響精液檢查結果。精液正常的男性若射精頻率增加會使精液活力與濃度降低,而對于精液異常的男性來說,短時間內增加射精頻率可以改善精子質量,使其活力提高[6-7]。精子質量是決定精卵結合效果的關鍵因素之一,為確保試管嬰兒技術的良好結局,增加不孕癥患者的受孕率,本次研究對精液異常患者短時兩次取精精液質量的差異性進行分析,以減少輔助生殖過程中的人為干預,為嬰兒試管技術的發展提供理論基礎。

精子是從睪丸產生,經附睪逐漸成熟并獲得運動能力,但受細胞凋亡、氧化應激損傷影響,有部分精子的活力會有所降低,隨著禁欲時間的延長,雖然附睪中的精子量會有所增加,但是質量會有明顯下降[8]。精液常規檢查中,精液量、總活力、前向動力、精子濃度、精子總數等是評估精液質量的參考指標。本次研究中,短時禁欲組的精液量、精子總數、DNA碎片率低于正常禁欲組,精子總活力、前向運動力、正常形態率高于正常禁欲組(P<0.05),提示精液異常患者將禁欲時間縮短可以提高精液標本的質量,為試管嬰兒技術的實施提高優質精子,可提高受孕率。成年男性的精子有一半儲存在附睪頭部和體部,另一半儲存在尾部,在某些情況下,精液異常患者第一次射精可能無法將附睪尾部的精子完全排空,因此需要在短時間內再次進行射精方可將附睪尾部的精子從輸精管排出,射精頻率增加會令精子通過附睪的速度增加,從而便會使精液標本中的精子濃度增加[9-11],精子通過附睪尾部的速度加快,則運動潛能便會有所增加,從而提高了精液質量。

精液異常患者精液生產速度過慢,精液數量也較低,禁欲時間越長,則其精液數量、精子總數會有所增加,但是正常形態率會有所降低。本文精子形態異常患者中,短時禁欲組的精子正常形態率高于正常禁欲組(P<0.05),提示縮短禁欲時間能提高精子正常形態比例,有利于提高受精率。精子DNA碎片率異常患者中,短時禁欲組精子DNA碎片率低于正常禁欲組(P<0.05),提示短時間禁欲能降低精子DNA碎片率,有利于提高活產率。精子在附睪內停留時間越長,其氧化損傷和細胞凋亡程度就會越嚴重,會直接降低精子活力,導致精子DNA損傷加劇,從而出現形態異常和DNA碎片的情況[12]。精子DNA的完整性在很大程度上會對精子的正常功能及精液常規參數造成直接影響,精子總數增高,活動精子百分比就會降低[13-14],而精液異常的患者精子濃度和存活率會隨著禁欲時間的延長而出現不同程度的減低,因此,精液異常者須采取較短的禁欲時間較為合理[15]。

綜上所述,精液異常患者縮短禁欲時間雖然會降低精液量和精子數量,但能獲取更高質量的精液標本,提高了精子總活力、前向運動力、正常形態率,降低了精子DNA碎片率,更有利于提高受孕率和活產率。由此可知,在實施試管嬰兒技術時,可以通過連續射精的方法解決受孕率低或精液質量不佳的問題,對生殖結局的改善具有非常重要的意義。