羥基紅花黃色素A對改善大鼠急性腦缺血/再灌注損傷作用研究

王 坤, 趙瑞杰, 張 茜, 李利峰, 趙 楊, 李喜朋

1.邢臺市第三醫院 神經內一科,河北 邢臺 054000;2.邢臺市人民醫院 神經內二科,河北 邢臺 054000

急性腦缺血在一定時間恢復血液供應后,其功能不但未能恢復,反而出現更加嚴重的腦機能障礙,這一現象稱為急性腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CI/RI)[1]。近年來,有研究報道,在急性CI/RI的發展過程中,腦組織中的炎性細胞因子釋放明顯增加,這些炎性因子能夠觸發一系列病理性級聯反應,這些級聯反應將直接或間接地導致細胞凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫和出血性轉化[2-5]。因此,抑制急性CI/RI發展過程中的炎癥反應可能是一種有效的預防和治療策略。菊科植物紅花是一種傳統中藥材,該植物的干燥花朵被認為是一種良好的活血化瘀藥。Xue等[6]研究發現,羥基紅花黃色素A(hydroxysaffloryellow A,HSYA)是紅花的主要成分,對心腦血管病具有顯著療效。然而,HSYA對于急性CI/RI作用機制的相關報道較少見。本研究通過建立大腦中動脈閉塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)損傷大鼠模型,探討HSYA對于急性CI/RI的作用機制,以期為CI/RI的預防提供新思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 SPF級雄性SD大鼠50只,體質量240～280 g,由江蘇邳州市東方養殖有限公司提供(SCXK 蘇2022-0016)。

1.1.2 試劑 HSYA購于美國sigma公司(純度>99.8%);戊巴比妥鈉購于武漢漢恒生物公司;4%多聚甲醛購于北京索萊寶生物科技有限公司;NeuN抗體購于美國Santa cruz公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司;酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司;脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)試劑盒購于杭州酶聯生物科技有限公司;NF-κB p65和GAPDH抗體購于美國賽默飛公司。

1.2.3 主要儀器 多功能酶標儀購于南京貝登電子商務有限公司;熒光顯微鏡購于德國Lavision Biotec公司;超低溫冰箱購于美國賽默飛公司;低溫離心機購于德國Eppendorf公司;電子天平購于上海拓西電子科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及模型建立 所有大鼠的飼養條件如下:溫度控制在21℃～23℃,55%適度恒定,12 h光照和12 h黑暗周期,自由獲取食物和水。將大鼠隨機分為5組:假手術組、模型組,以及HSYA低、中、高劑量組,每組各10只。參照參考文獻[7]建立大鼠MCAO/R模型。首先使用0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,用鉗分離左側頸總動脈,將6-0尼龍絲從左側頸總動脈切口插入大腦中動脈以阻斷血液。阻斷2 h后,拔除纖絲進行再灌注。當大鼠出現提尾時左前肢不能伸直、行走時向左側旋轉或傾倒時,可判斷MCAO/R模型構建成功。

手術前30 min內,HSYA低、中、高劑量組的大鼠通過尾靜脈分別注射10、20、30 mg/kg的HSYA,假手術組和模型組的大鼠均注射等量生理鹽水。模型組和HSYA低、中、高劑量組均按上述方法建立MCAO/R模型,假手術組的大鼠僅在頸部剪口并縫合,但未發生MCAO/R。術后24 h,使用戊巴比妥鈉將所有大鼠麻醉致死,取腦組織進行后續研究。所有動物實驗均經本院實驗動物倫理委員會批準通過。

1.2.2 氯化三苯基四氮唑染色 造模成功24 h后,深麻醉下斷頭,提取除小腦、嗅球和下腦干外的腦組織,轉入PBS溶液中清洗,然后在-20℃冷凍20 min,切取組織塊,獲得2 mm冠狀腦片。將切片顯露于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中,37℃避光水浴30 min。每隔5 min搖晃1次,以確保染色均勻。隨后,將染色的組織樣本用4%多聚甲醛固定過夜,第22天干燥用于攝影。運行Image-ProPlus 6.0軟件獲得尾部梗死面積(白色),根據層厚計算梗死體積。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色 將完整腦組織分離、固定、洗滌、脫水后進行透明處理并通過石蠟包埋。獲得后視交叉的冠狀切面(5 μm)。然后,切片經二甲苯和乙醇脫蠟至水,再用蘇木精-伊紅染色。制備組織切片,顯微鏡下觀察皮質神經元形態。

1.2.4 神經元凋亡率檢測 通過TUNEL和NeuN免疫熒光雙染檢測大鼠腦海馬區的神經元凋亡情況。采用細胞凋亡檢測試劑盒和抗NeuN單克隆抗體進行免疫熒光雙標記。在TUNEL標記前,將4 μm厚的腦切片與抗NeuN一級抗體(1:200稀釋度)在4℃孵育過夜,隨后在室溫下與免疫熒光標記的二級抗體孵育1 h。對于TUNEL標記,切片與含有末端脫氧核苷酸轉移酶和熒光素標記的脫氧尿苷三磷酸的反應混合物在37℃孵育2 h。室溫下Hoechst染色5 min。采用全自動熒光顯微鏡拍攝染色結果。

1.2.5 酶聯免疫吸附實驗 用包被緩沖液將大鼠腦組織勻漿液稀釋至1～10 μg/ml,每孔加0.1 ml,4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被的反應孔中,置37℃孵育1 h,洗滌。于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體0.1 ml,37℃孵育30～60 min,洗滌,最后一遍用磷酸鹽緩沖液洗滌。應用多功能酶標儀檢測吸光度。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗 收集1.2.5實驗中勻漿后的腦組織樣本,使用蛋白裂解液獲取總蛋白后,通過考馬斯亮藍法對各組蛋白樣本定量。使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離目的蛋白,電泳結束后將目的蛋白轉移至PVDF膜上,然后在5%脫脂牛奶封閉,分別與一級抗體和二級抗體孵育、洗膜、顯影,將獲得的蛋白條帶進行標記,應用Image Lab軟件測定蛋白條件灰度值,并計算NF-κB p65蛋白的相對表達量。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應 收集1.2.5實驗中勻漿后的腦組織樣本,按照說明書在勻漿液中添加500 μl RNA提取裂解液,用于提取總RNA。利用逆轉錄試劑盒將每個樣本的RNA逆轉錄為cDNA。以GAPDH為內參,使用SYBR Green對目的基因的表達量進行定量,所使用的引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 HSYA對MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色結果顯示,與假手術組大鼠比較,模型組大鼠腦梗死面積顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組大鼠比較,HSYA低、中、高劑量組大鼠腦梗死面積顯著減少,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 HSYA對MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響

2.2 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織結構的影響 蘇木精-伊紅染色結果顯示,假手術組大鼠海馬神經細胞排列整齊緊密,細胞核大而圓,細胞結構清晰。與假手術比較,模型組大鼠海馬神經細胞排列紊亂,體積減小,細胞核形狀不規則,部分細胞核皺縮,呈三角形;與模型組比較,隨著劑量遞增,HSYA低、中、高劑量組大鼠海馬神經細胞的損傷程度逐漸恢復正常,細胞排列較為整齊,細胞核逐步增大變圓。見圖2。

圖2 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織結構的影響

2.3 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織神經元凋亡的影響 TUNEL和NeuN熒光染色結果顯示,與假手術比較,模型組大鼠海馬神經細胞凋亡率明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA低、中、高劑量組的大鼠海馬神經細胞凋亡率明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織神經元凋亡的影響

2.4 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織炎性因子水平的影響 ELISA與實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠腦組織中炎性因子水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA組大鼠腦組織中炎性因子水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織炎性因子水平的影響

2.5 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織中NF-κB p65表達水平的影響 蛋白免疫印跡結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠腦組織中NF-κB p65表達水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,HSYA低、中、高劑量組大鼠腦組織中NF-κB p65表達水平顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 HSYA對MCAO/R大鼠腦組織中NF-κB p65表達水平的影響

3 討論

近年來,MCAO/R動物模型通常用于模擬大腦中動脈閉塞發病后的病理狀況,已被廣泛用于各類新藥的開發研究中[8-10]。本研究建立了大鼠MCAO/R模型,以探討HSYA對CI/RI的影響。有研究報道,局灶性CI/RI通常會引起缺血皮質神經元的形態學改變和功能障礙,24 h后導致最嚴重的腦梗死,大腦中動脈的供血區域有明顯的梗死灶[11-12]。本研究建立MCAO/R大鼠模型后,與假手術組大鼠比較,模型組腦梗死面積顯著增加,海馬區域神經細胞排列紊亂、核仁消失、部分核質皺縮,炎性因子水平顯著增加,這提示本研究的MCAO/R大鼠模型建立成功。

有研究報道,HSYA具有較好的抗炎、抗氧化作用,對于心腦血管病具有顯著療效[13]。如Zhang等[14]研究報道,HSYA是一種潛在的神經系統保護劑,可抑制大鼠脊髓損傷過程中的氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡的發展。此外,HSYA還是一種治療動脈粥樣硬化的天然產物,其可抑制泡沫細胞形成,改善血管內皮細胞功能障礙,抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移[15-16]。在本研究中,通過向MCAO/R大鼠注射HSYA后,MCAO/R大鼠腦梗死面積顯著減少,神經細胞的損傷程度和凋亡率降低,腦組織中炎性因子水平顯著降低。這提示,HSYA能夠降低MCAO/R大鼠腦組織中炎性因子水平,緩解大鼠CI/RI。NF-κB p65是NF-κB家族成員之一,NF-κB是一種多效性轉錄因子,且炎癥反應與NF-κB p65的異常激活密切相關[16]。本研究結果發現,在MCAO/R大鼠腦組織中,NF-κB p65顯著增加,然而,HSYA低、中、高劑量組中,隨著劑量增加,NF-κB p65表達逐漸降低。因此,HSYA的抗炎作用可能與抑制NF-κB p65表達相關。

綜上所述,HSYA能夠降低MCAO/R大鼠腦組織中炎性因子水平,緩解大鼠腦缺血/再灌注導致的神經細胞損傷,且這一作用可能與抑制NF-κB p65表達相關。HSYA可能是預防CI/RI的有效藥物。