胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測對軍隊不孕不育夫婦輔助生殖臨床結局影響研究

鄒朋書, 王喜良, 魏 威, 檀 暢, 于月新, 于佳平

北部戰區總醫院 生殖醫學科,遼寧 沈陽 110016

胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(preimplantation genetictesting for aneuploidies,PGT-A)是輔助生殖過程中在植入前對胚胎染色體的非整倍體性進行的遺傳學檢測,可指導選擇染色體為整倍體的優質胚胎進行移植以降低移植失敗或早期自然流產的風險,臨床廣泛應用于高齡、反復移植失敗及復發性流產患者[1-2]。高通量測序技術又稱下一代測序技術,能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定,具有成本低、通量大、速度快、穩定性好及結果精準等特點[3-4],其通過對胚胎活檢滋養層細胞的全基因組測序進行胚胎染色體的非整倍體檢測。胚胎染色體非整倍體屬于染色體數目異常,是自發性流產、胎兒出生缺陷、發育異常、嚴重智力低下的主要原因之一。據歐洲人類生殖與胚胎學會的PGT-A統計,2016—2017年共活檢4 033枚胚胎,僅有34%的胚胎染色體是整倍體,62%為非整倍體,另有4%為嵌合體[5]。軍隊官兵是一個特殊的群體,職業、環境、心理及任務的特殊性使其晚婚晚育現象較為普遍,且婚后兩地分居是常態,因此,延遲生育及不孕不育的問題較為突出,許多官兵夫婦需要通過輔助生殖技術來解決生育問題[6-7]。本研究旨在探討PGT-A對軍隊不孕不育夫婦輔助生殖臨床結局的影響。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析北部戰區總醫院自2018年1月至2021年12月收治的接受輔助生殖技術治療的509對不孕不育官兵夫婦中女性患者的臨床資料。將未行PGT-A且未進行鮮胚移植的269例患者納入A組,共285個單囊胚凍融移植周期。其中,高齡(年齡≥35歲)178例,共192個凍融移植周期;復發性流產(將自然流產≥3次、妊娠周數<28周且染色體未見異常者歸為復發性流產)55例,共61個凍融移植周期。將行PGT-A的240例患者納入B組,共305個單囊胚凍融移植周期。其中,高齡102例,共127個凍融移植周期;復發性流產103例,共136個凍融移植周期;染色體異常78例,共98個凍融移植周期。除去染色體異常的78例后,將B組中剩余的162例以年齡為依據進行分組,分為年齡<35歲組、35～37歲組及年齡≥38歲組。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養和囊胚活檢 常規促排卵后,經陰道超聲引導下取出卵子。對MⅡ的成熟卵母細胞通過卵胞漿內單精子顯微注射技術進行體外授精,在卵裂輸卵管液培養液(ART-1026)中培養60～72 h,再轉移至囊胚輸卵管液培養液(ART-1029)中培養48～72 h。活檢篩選4期及以上且內細胞團或外滋養層達到C級以上的囊胚進行滋養層細胞活檢。使用激光在待活檢囊胚的內細胞團對側位置打一個直徑約50 μm的孔,將活檢針對接缺口處吸取6～8個滋養層細胞,用激光法及機械法使之脫離囊胚。將活檢的細胞轉移至裝有磷酸鹽緩沖液的PCR管中,放置冰盒中送檢。

1.2.2 全基因組擴增及非整倍體檢測 對活檢的滋養層細胞進行全基因組SurePlex擴增,使用PGT-A試劑盒(北京中儀康衛醫療器材有限公司)進行全基因組擴增和文庫構建。采用Illumina測序平臺MiSeqDx測序儀進行測序,測序數據采用《胚胎染色體異倍體分析系統》軟件(北京中儀康衛醫療器材有限公司)對染色體拷貝數進行分析。分析方法為:測序數據經過質控后,比對到人參考基因組上,將整個參考基因組分為若干窗口并計算窗口的reads數,然后通過數據校正,結合參考數據集確立的參考范圍采用生物信息學算法進行拷貝數分析,檢測分辨率為4 Mb。

1.3 觀察指標 比較B組不同年齡患者的胚胎染色體整倍體率,A組和B組不同年齡患者的臨床結局,A組和B組復發性流產患者的臨床結局,以及B組各類染色體異常患者的整倍體率、臨床結局。胚胎檢測結果判讀標準:檢測結果中無整條染色體異常和片段性異常及嵌合情況。非整倍體異常:只要檢測結果中存在染色體非整倍體(包括嵌合情況)即為染色體整倍性異常。

胚胎染色體整倍體率=胚胎染色體整倍體囊胚數/檢測成功活檢囊胚數×100%

臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/凍融移植周期×100%

活產率=活產周期數/凍融移植周期×100%

早期流產率=胚胎停育及孕12周以內流產周期數/臨床妊娠周期數×100%

2 結果

2.1 B組不同年齡患者胚胎染色體整倍體率比較 年齡<35歲組60例,平均年齡(31.35±2.24)歲,活檢囊胚數304枚,整倍體囊胚數177枚,整倍體率58.22%(177/304)。35～37歲組40例,平均年齡(36.10±0.75)歲,活檢囊胚數190枚,整倍體囊胚數98枚,整倍體率51.04%(98/190)。年齡≥38歲組62例,平均年齡(40.18±1.90)歲,活檢囊胚數289枚,整倍體囊胚數122枚,整倍體率42.21%(122/289)。年齡<35歲組整倍體率明顯高于年齡≥38歲組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 A組和B組不同年齡患者臨床結局比較 (1)在年齡<35歲年齡段:A組患者91例,凍融移植周期93個,臨床妊娠率58.06%(54/93),活產率46.24%(43/93),早期流產率18.52%(10/54);B組患者60例,凍融移植周期80個,臨床妊娠率65.00%(52/80),活產率53.75%(43/80),早期流產率13.46%(7/52);兩組臨床妊娠率、活產率、早期流產率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。(2)在35～37歲年齡段:A組患者63例,凍融移植周期69個,臨床妊娠率50.72%(35/69),活產率40.58%(28/69),早期流產率20.00%(7/35);B組患者40例,凍融移植周期53個,臨床妊娠率60.38%(32/53),活產率49.06%(26/53),早期流產率15.63%(5/32);兩組臨床妊娠率、活產率、早期流產率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。(3)在年齡≥38歲年齡段:A組患者115例,凍融移植周期123個,臨床妊娠率39.02%(48/123),活產率20.33%(25/123),早期流產率43.75%(21/48);B組患者62例,凍融移植周期74個,臨床妊娠率56.76%(42/74),活產率43.24%(32/74),早期流產率21.43%(9/42);A組臨床妊娠率和活產率低于B組,早期流產率高于B組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 A組和B組復發性流產患者臨床結局比較 A組55例,平均年齡(35.72±4.51)歲,凍融移植周期61個,臨床妊娠率55.74%(34/61),活產率32.79%(20/61),早期流產率41.18%(14/34)。B組103例,平均年齡(35.58±4.29)歲,凍融移植周期136個,活檢474個,整倍體率52.53%(249/474),臨床妊娠率61.03%(83/136),活產率47.06%(64/136),早期流產率19.28%(16/83)。A組和B組復發性流產患者平均年齡、臨床妊娠率、活產率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。B組復發性流產患者早期流產率低于A組,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 B組各類染色體異常患者整倍體率和臨床結局比較 78例染色體異常中:相互易位27例,活檢囊胚數156枚,整倍體囊胚數39枚,整倍體率25.00%(39/156),凍融移植周期33個,臨床妊娠率69.70%(23/33),活產率63.64%(21/33),早期流產率8.69%(2/23);羅氏易位19例,活檢囊胚數102枚,整倍體囊胚數44枚,整倍體率41.51%(44/102),凍融移植周期25個,臨床妊娠率68.00%(17/25),活產率64.00%(16/25),早期流產率5.88%(1/17);倒位12例,活檢囊胚數38枚,整倍體囊胚數22枚,整倍體率57.89%(22/38),凍融移植周期16個,臨床妊娠率75.00%(12/16),活產率75.00%(12/16),早期流產率0(0);染色體非整倍體5例,活檢囊胚數22枚,整倍體囊胚數12枚,整倍體率54.55%(12/22),凍融移植周期7個,臨床妊娠率28.57%(2/7),活產率28.57%(2/7),早期流產率0(0);Y染色體微缺失15例,活檢囊胚數46枚,整倍體囊胚數18枚,整倍體率39.13%(18/46),凍融移植周期17個,臨床妊娠率76.47%(13/17),活產率70.59%(12/17),早期流產率7.69%(1/13)。各類染色體異常整倍體率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。各類染色體異常臨床妊娠率、活產率、早期流產率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

胚胎的非整倍性是體外受精失敗的主要原因,在世界范圍內,已有多個生殖中心通過對胚胎活檢并運用高通量測序技術進行PGT-A[8]。胚胎的非整倍體與女性年齡高度相關,隨著女性年齡的增加,卵子減數分裂過程中發生錯誤的風險升高,卵母細胞發育長期停滯,受精后有絲分裂異常,導致胚胎染色體嵌合[9]。軍隊官兵晚婚晚育現象普遍,婚后兩地分居導致了延遲生育,女方生育年齡普遍偏高。本研究結果顯示,年齡<35歲組整倍體率明顯高于年齡≥38歲組,差異有統計學意義(P<0.05)。這提示,女方年齡越大,胚胎染色體整倍體率越低。本研究結果還顯示,在年齡≥38歲年齡段,A組臨床妊娠率39.02%(48/123)、活產率20.33%(25/123)、早期流產率43.75%(21/48),B組臨床妊娠率56.76%(42/74)、活產率43.24%(32/74)、早期流產率21.43%(9/42),A組臨床妊娠率和活產率低于B組,早期流產率高于B組,差異有統計學意義(P<0.05)。這提示,年齡≥38歲的女性患者更應該選擇PGT-A以進行胚胎篩選,這能幫助不孕不育夫婦獲得更好的臨床結局,與既往研究[10]結論一致。高齡患者行PGT-A面臨的極大困難是,較多高齡女性的卵母細胞募集數量少且質量差,胚胎很難培養直至囊胚期行活檢。

復發性流產患者利用PGT-A技術對胚胎染色體進行整倍體篩選,對拷貝數正常的胚胎進行移植,可有效阻斷染色體異常胚胎植入,能夠增加復發性流產患者的胚胎著床率,提高臨床妊娠率,降低自然流產發生率[11-12],有效避免因胚胎染色體非整倍體導致的種植失敗,以及因胚胎染色體異常所導致的復發性流產。本研究中,A組和B組復發性流產患者臨床妊娠率、活產率比較,差異均無統計學意義(P>0.05),B組復發性流產患者早期流產率低于A組(P<0.05)。隨著軍隊不孕不育患者對輔助生殖臨床妊娠率、活產率等要求的逐漸提高,越來越多復發性流產患者選擇采取PGT-A助孕,減少因反復流產帶來的傷害。

染色體相互易位、羅氏易位、Y染色體微缺失等易導致胚胎非整倍體發生。在生殖細胞減速分裂過程中,相互易位染色體在減數分裂配對時形成4射體,將產生18種配子,其中,1/18是攜帶者,1/18是完全正常,16/18是異常。羅氏易位染色體在減數分裂配對過程中形成3射體,染色體分離時產生6種配子,1/6是攜帶者,1/6是完全正常,4/6是異常。倒位配子在減數分裂時形成倒位環,分離后形成4種配子,1/4是正常,1/4是攜帶者,2/4為部分重復和缺失的無著絲粒或雙著絲粒的不平衡配子。本研究中,染色體相互易位、羅氏易位、倒位患者的整倍體率分別為25.00%(39/156)、41.51%(44/102)、57.89%(22/38),正常胚胎概率均高于理論值[13]。這可能是由于活檢篩選4期及以上的囊胚且內細胞團或外滋養層達到C級以上,胚胎在體外培養過程中,有些胚胎因為染色體的非整倍體停滯發育,無法順利形成囊胚[14-15]。染色體非整倍體5例患者分別為:2例47,XXX;1例45,X[45]/47,XXX[55];1例47,XXX[13]/46,XX[51];1例47,XYY。上述患者均涉及性染色體的非整倍體或性染色體非整倍體嵌合,患者性染色體異常通常會造成卵巢子宮發育情況欠佳[16],導致臨床妊娠率和活產率較低。染色體相互易位、羅氏易位、倒位、Y染色體微缺失患者行PGT-A將整倍體胚胎移植后,臨床妊娠率達到70%左右、活產率達到60%～75%,臨床效果顯著。對于染色體異常的軍隊不孕不育夫婦,PGT-A可大大提高臨床妊娠率和活產率,降低早期流產風險,改善臨床妊娠結局。

綜上所述,對于軍隊不孕不育夫婦,PGT-A可有效改善高齡患者妊娠結局,避免因染色體非整倍體性增加而導致的自然流產,降低復發性流產患者的早期流產率,提高活產率。