流蘇樹種子霉變環境條件與致霉菌種類研究

成彥麗，周國林，楊竟然，袁本園，徐晨，王雪娟

1.安徽科技學院建筑學院，安徽 蚌埠 233000 2.安徽水利生態環境建設有限公司，安徽 蚌埠 233000

流蘇樹(Chionanthusretusus)又名炭栗樹、四月雪、晚皮樹、鐵黃荊、糯米花、茶葉樹等，為木樨科流蘇樹屬的一種落葉喬木或灌木，是我國特有的二級保護植物[1-2]。成年流蘇樹樹形高大、枝葉茂盛，花朵像雪一樣潔白，花形較為纖細，盛開時像天上的云朵一般，清香四溢，具有良好的觀賞效果，在園林綠化中可作行道樹、點綴或群植等[3]。流蘇樹喜光、耐蔭、耐旱、耐寒、耐瘠薄，喜濕潤肥沃的河溝、沙壤土、碎石山地等，對土壤適應性強。該植物是嫁接桂花的優良砧木，嫁接后的桂花觀賞效果與生活力明顯優于白蠟、女貞等其他砧木[4-5]。另外，流蘇樹還具有一定的其他經濟價值，如它的嫩葉可以代茶作飲料，其香氣不亞于“龍井”；果實含油量大，可榨油供工業用[6]。

盡管流蘇樹用途廣泛，但其種子繁殖卻比較困難[2]。流蘇種子外殼較為堅硬，果實成熟落地后，在秋季先長出胚根，于第二年春天才能長出胚芽，胚芽和胚根呈現不同步休眠。流蘇的種子為“二年種子”。因此流蘇種子發芽速度較慢[4-6]。流蘇種子在室內常溫干燥貯藏和濕沙催芽過程中極易發生霉變現象。有學者認為在大田條件下其發芽需要干燥略微潮濕環境，以保證種子不爛安全度過第二年夏天，如果水分控制不慎，流蘇種子極易發霉腐爛，導致發芽率很低甚至不發芽[6]。為此，筆者對流蘇種子含水量、吸水率及生活力等進行了檢測；同時觀測了室溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽種子的霉變環境條件，了解霉變對種子生活力和萌發力的影響，并對導致其霉變的菌種進行初步研究，以期為流蘇種子的科學貯藏和正常萌發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

流蘇種子于2021年1月購于大博種業；赤霉素購于北京索萊寶科技有限公司；高錳酸鉀購于上海新瑞精細化工有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇(無水乙醇)購于滬試國藥集團化學試劑有限公司；濕沙要求沙子手握成團，無水流出，手松開后沙團有裂縫，一碰即散。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子質量檢測

檢測種子凈度、千粒重、含水量、生活力、吸水率，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定種子活力[7]。

1.2.2 種子形態測定

隨機取50粒流蘇種子，用游標卡尺分別測量種子縱和寬，計算平均數與極值。

1.2.3 發霉現象觀察

①室溫貯藏種子霉變現象：4月上旬，室內常溫貯藏種子出現霉變現象。②室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過程中的霉變現象：2020年1月取流蘇種子若干，用25 ℃的自來水浸泡48 h后，將濕沙與種子以3∶1的比例混合，在室溫條件下層積；3月上旬取出層積種子，用0、100、200、300、400、500、600 mg/L的赤霉素進行處理，然后繼續置于濕沙中室溫催芽。自3月底起，不同處理的流蘇種子無發芽跡象且開始出現霉變。

1.2.4 發霉環境條件分析

流蘇種子發霉現象主要出現在4月上旬，在中國天氣網(http：//www.weather.com.cn/)上搜尋4月1日至4月15日試驗地的最高氣溫、最低氣溫、相對濕度以及降雨時間。用日最高、最低溫平均法計算日均溫；用某一段時間內逐日平均氣溫≥10 ℃持續期間日平均氣溫的總和，即活動溫度總和來計算積溫。

1.2.5 致霉菌種類鑒定

取室內常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的霉變種子為樣品提取感染致霉菌的DNA，進行ITS擴增。經過樣本檢測、PCR、純化、建庫、測序等環節，測序得到原始數據(Raw Data)。對Raw Data進行拼接、過濾，得到有效數據(Clean Data)，進一步降噪，得到ASVs序列。基于ASVs序列在數據庫中進行比對分析，得到溫室內常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽種子的致霉菌種類和豐度，并分析這些致霉菌的Alpha多樣性。

2 結果與分析

2.1 種子生活力分析

該批種子的千粒重為200.90 g，凈度約為93.90%，含水量約為13.35%。通過TTC染色法觀察種胚染色情況，發現未發霉的流蘇種子種胚被染成紅色，即具有成活力的種子45粒，不顯色的無生活力的種子5粒，正常流蘇種子生活力較高達到81.82%。室內常溫干燥貯藏條件下發生霉變的流蘇種子具有生活力的種子22粒，無生活力的種子28粒，發霉流蘇生種子活力不高，僅有44.00%。

2.2 種子形態分析

采用游標卡尺測量50粒流蘇種子的縱和寬，可知流蘇種子的縱約為11.70 mm，寬約為4.04 mm。其中縱的最大值達15.35 mm，寬的最大值達到4.97 mm；縱的最小值為7.71 mm，寬的最小值為3.10 mm。

2.3 種子吸水率分析

流蘇種子種皮的透水性如圖1所示，流蘇種子去殼與不去殼的透水性不同，但最終吸水率差別不大。浸泡12 h時去殼與不去殼種子吸水率都接近32.00%，在浸泡12 h前，不去殼種子的含水量高于去殼種子；在浸泡12 h后相反，去殼種子含水量高于不去殼種子。由圖1可知，去殼后的種子吸水速率增長較大，并且持續上升，在96 h時達到吸水率最高值84.11%。96 h時不去殼種子吸水率為72.30%。隨著浸泡時間的增加，發現流蘇出現了霉變現象。試驗結果表明，流蘇種子去殼和不去殼的對其吸水率影響不大。

圖1 流蘇種子吸水率Fig.1 The water absorption of C.retusus seeds

2.4 霉變現象觀察與分析

解剖室內常溫干燥貯藏的霉變不去殼種子，發現種殼內外均出現黑色致霉菌，種皮上附著黑色致霉菌較多且伴有少量白色絨毛狀致霉菌，4月上旬霉變率為60.00%。同時花盆里室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的種子也出現種皮皺縮、發霉潰爛的現象(見圖2)。通過查詢中國天氣網，發現種子發霉時間段里的最高氣溫為22 ℃，最低氣溫為7 ℃，日均溫為14.2 ℃，相對濕度為67%，降水時間為1 d，積溫為63.5 ℃。此條件下流蘇種子在常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽試驗過程中均極易發生霉變，在生產實踐中應該注意溫度與濕度的控制，從而避免發霉。

(a)室溫干燥貯藏的流蘇種子 (b)室溫干燥貯藏的流蘇種子內部霉變情況 (c)室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的流蘇種子圖2 流蘇種子發霉現象Fig.2 The mildew phenomenon of C.retusus seeds

2.5 致霉菌多樣性分析

常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的流蘇種子測序覆蓋度(goods coverage)結果均較高(為1)。常溫干燥貯藏種子致霉菌群落樣品中共鑒定與拼接出99條ASV序列，其Shannon指數(樣品中的分類總數及其占比)和Simpson指數(群落內物種分布的多樣性和均勻度)分別為3.04和0.8。室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽樣品中只有35條ASV序列，Shannon指數、Simpson指數分別為0.27、0.06。常溫干燥貯藏種子致霉菌群落多樣性高于室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽樣品，兩者重復的ASV序列有18條。

2.6 致霉菌種類鑒定結果與分析

室內常溫干燥貯藏的霉變種子中共鑒出40種致霉菌。其中帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)的豐度為33.93%，脂節擔菌(Wallemiasebi)的豐度為31.20%；踝節菌(Talaromycesatroroseus)、圓錐曲霉(Aspergillusconicus)、Aspergillusglabripes、Zygoascuspolysorbophila、喬治亞青霉(Penicilliumgeorgiense)、朱黃籃狀菌(Talaromycesminioluteus)的豐度則較低，分別為8.53%、1.10%、0.45%、0.42%、0.39%和0.22%。因此室內常溫干燥貯藏種子中的致霉菌主要是帚狀曲霉和脂節擔菌踝節菌(見圖3)。

圖3 流蘇種子致霉菌的相對豐度Fig.3 The relative abundance of mildew fungus in C.retusus seeds

室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽發霉種子中共鑒定出13種致霉菌。其中茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)的豐度最高，為97.30%。其他的真菌類型Pithyavulgaris、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、Fusicollaseptimanifiniscientiae、Tausoniapullulans、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、Fusariumlacertarum、帚狀曲霉、脂節擔菌的豐度分別為1.29%、0.34%、0.22%、0.10%、0.04%、0.03%、0.12%、0.12%，所占比例均極低。據此可知，濕沙催芽霉變種子上附著的致霉菌主要為茄病鐮刀菌(見圖3)。雖然帚狀曲霉和脂節擔菌在室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽發霉種子菌群中也存在，但豐度較低，這表明引起流蘇種子室內常溫干燥貯藏和濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的主要霉變菌種不同。

3 討論與結論

3.1 種子發霉現象分析

研究中流蘇種子霉變高發期的時間段為4月中旬，通過觀察分析發現流蘇種子在日均溫14.2 ℃，最高氣溫為22 ℃，相對濕度為67.00%的環境條件下易發生霉變。相關研究也表明，淀粉、油脂等含量高的種子在一定溫度、濕度條件下容易發生霉變現象[8-10]。劉愛民等[8]在研究雜交水稻劣變特性時，考察了6個母本系品種的雜交種子，發現降雨高濕是雜交水稻種子霉變現象普遍存在的原因。楊書香等[10]基于武漢市四季溫度和濕度設置4個不同的溫度和濕度進行正交試驗，研究花生的霉變情況，發現花生種子在18 ℃、70%的濕度條件下處理3 d后出現霉變現象，在18 ℃、95%的濕度條件下處理3 d后霉變率為30%，在28 ℃、90%的濕度環境中3 d霉變率達80%；初步鑒定霉變菌種為黃曲霉菌和黑曲霉菌。劉龍龍等[11]發現收獲期的燕麥籽粒在夜間氣溫8～13 ℃、白天溫度15～25 ℃且濕度較高的環境中易發生霉變。蔣淑儒等[12]通過觀察發現濕度大的環境中油茶籽更容易發生霉變現象。

本研究中流蘇種子千粒重為200.90g，凈度為93.90%，含水量為13.35%，種子縱、寬的平均數分別為11.70、4.97 mm，種子質量檢測結果表明該批種子質量良好[13-14]。TTC種子活力檢測發現正常流蘇種子生活力為81.82%，霉變后的生活力為44.00%，這表明室內干燥貯藏過程中發生霉變會導致部分種子失活、生活力下降。吸水率試驗表明流蘇種子萌發過程中所需水分沒有受到種殼限制，但隨著浸泡時間的增長出現了霉變現象；在室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過程中，發霉現象嚴重無法發芽，因此在流蘇種子發芽過程中亦應嚴格防霉。

3.2 致霉菌的危害及防治分析

基于高通量測序發現流蘇樹種子常溫干燥貯藏過程中帚狀曲霉和脂節擔菌豐度最高。濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過程種茄病鐮刀菌的豐度最高。帚狀曲霉可以在極端干旱、低濕、鹽漬和厭氧環境條件中生存，常見于室內灰塵、人體皮膚和干燥的食物等介質[15-16]。脂節擔菌為節擔菌屬(Wallemia)的一種耐干旱性真菌，在海洋、土壤以及室內和室外廣泛存在，可以引起甜點類食物(水果、蛋糕、面包等)、咸腌類食物(咸干魚、咸花生、咸肉等)及烘干類食物腐敗，同時可以引起蘋果煤污病，是煤污病菌類群中唯一的一個擔子菌種類[17-21]。茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)作為分解者在土壤、發霉腐爛的植物材料中廣泛存在，是許多重要農作物、動物甚至人類身體中的病原體[22-26]。茄病鐮刀菌可以侵染多種作物，引起植物發生根腐病、莖腐病等癥狀，比如丹參根腐病、苜蓿根腐病、菜豆根腐病、人參根腐病、百合枯萎病、薯干腐病、桉樹枯萎病、橡膠樹莖桿潰瘍病、咖啡黑果病、大豆猝死癥等多種疾病，造成巨大經濟損失[25-28]。有研究表明茄病鐮刀菌菌絲生長和產孢適宜碳源依次為淀粉、麥芽糖；適宜氮源依次為蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀，最適合溫度為25～30 ℃，最適pH為7～8，濕度對孢子萌發影響較大，完全光照有利于病原菌生長[29]。

為防止流蘇種子在貯藏過程中發霉，務必嚴格控制種子含水量，同時應注意密封，以抑制旱生真菌的大量繁殖[30]。在流蘇種子催芽前應嚴格對種子和基質進行消毒，發芽過程中如出現霉變現象，應及時施用殺菌劑如甲基硫菌靈可濕性粉劑、多菌靈等[31- 35]。