羊草LcZIP1 的鐵轉運功能鑒定

亢燕，王耀輝，牛天慧，滕哲，祁智，楊佳

（內蒙古大學牧草與特色作物生物學教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070）

羊草（Leymus chinensis）屬于小麥族（Triticeae）賴草屬（Leymus），是多年生禾草。羊草是我國重要的鄉土植物，廣泛分布在我國北方草原，具有較高的飼用價值、生態價值和經濟價值。以羊草為主的草場是優質天然放牧場和割草場。羊草的研究始于1974 年，主要集中在種質資源、栽培和生物學特性等方面[1］。牧草礦質營養直接影響牧草和草原家畜的產量和質量，進而影響草原的生產力。然而關于羊草礦質營養吸收的分子調控機理研究較少。影響植物礦質營養吸收主要有兩個因素，一是外在因素，即土壤的礦質元素含量。已有研究發現外源施加微肥即鋅、銅、硼、鉬等可以顯著提高羊草干草的質量和產量，增產高達近50%[2］；氮結合鉀、硫、鋅、銅可以促進羊草生長[3］；二是內在因素，即植物體內的礦質元素轉運蛋白和相關調控因子[4-5］。在羊草中已發現鋅轉運蛋白LcZNE1，具有鋅結合和轉運功能，參與響應高鋅和低鐵條件[4］。

鋅鐵轉運蛋白（zinc-regulated transporter/iron-regulated transporter-like proteins，ZIP）在古菌、細菌、真菌、植物和哺乳動物中廣泛存在，負責金屬二價陽離子如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+和Cd2+等的吸收和轉運[5］。其中Fe、Zn、Cu、Mn 和Ni 是必需微量元素，其作為酶結構的一部分或輔因子介導植物的生長、發育和代謝[6］。Fe 具有氧化還原作用，在光合作用和呼吸作用的電子傳遞鏈中起著重要作用，參與氮同化、激素合成、活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除以及生物脅迫響應等[6-7］。Zn 是多種酶的組成部分和輔因子，與維持生物膜的結構完整、蛋白質合成以及種子發育等相關[6］。預計有1200 多種蛋白質內包含Zn2+、結合Zn2+或運輸Zn2+，這些蛋白包括鋅指蛋白、轉錄因子、氧化還原酶和水解酶等。

目前，ZIP 家族在模式植物和農作物中受到越來越多的關注，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8-9］、煙草（Nicotiana tabacum）[10］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[11］、野生二粒小麥（Triticum turgidumssp. dicoccoides）[12］、大麥（Hordeum vulgare）[13］、谷子（Setaria italica）[14］、水 稻（Oryza sativa）[15-16］、玉米（Zea mays）[17］、大豆（Glycine max）[18］、菜豆（Phaseolus vulgaris）[19］、葡萄（Vitis vinifera）[20］和臍橙（Citrus sinensis）[21］。目前Zn2+和Fe2+轉運功能鑒定的主要手段是通過離子轉運缺陷酵母突變體功能互補驗證，常使用的突變體為Zn2+轉運蛋白缺陷突變體（?zrt1/?zrt2、?zrc1/?cot1）和Fe2+吸收缺陷突變體（?fet3/?fet4）。在模式植物擬南芥中發現，AtZIP1、AtZIP2、AtZIP3、AtZIP7、AtZIP11 和AtZIP12 能夠使酵母的Zn2+轉運蛋白缺陷突變體（?zrt1/?zrt2）恢復Zn2+吸收功能，AtZIP7 也能使酵母的Fe2+吸收缺陷突變體（?fet3/?fet4）恢復Fe2+吸收功能。這些結果證明了AtZIP 的Zn2+或Fe2+轉運功能[8-9］。此外還發現，水稻OsZIP1 能使酵母鋅轉運蛋白缺失突變體?zrc1在高鋅條件下正常生長，從而證明OsZIP1 具有鋅轉運功能。已有研究表明，OsZIP1在過量的鋅、銅和鎘的條件下被誘導表達，表達產物定位于內質網和質膜上，阻止水稻中過量的鋅、銅和鎘積累[16］。

目前關于羊草ZIP 家族成員的表達、定位和功能的研究鮮有報道。羊草ZIP 家族成員的挖掘可為了解羊草微量元素吸收和轉運的機理以及對日后禾本科作物遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養

將野生羊草種子（于2018 年采集自內蒙古和林格爾縣）置于無菌水中，4 ℃處理3 d 后，收集飽滿種子進行表面消毒（浸入5% NaClO+0.1% Triton X-100 中，置于搖床150 r·min-1震蕩2 h 后用無菌水洗3~5 次）。此后將無菌的羊草種子點播于MQA-CK 培養基（5 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgSO4、1 mmol·L-1H3PO4、1/2 MS Fe 鹽、1/2 MS 微量、5 mmol·L-14-嗎啉乙磺酸、1%蔗糖、1%瓊脂糖，pH 5.7[22］）。將培養基置于生長室，黑暗中培養5 d 后進行光照培養（光強度：100 μmol·m-2·s-1；光周期：12 h 光照/12 h 黑暗；溫度：22~25 ℃）。

1.2 生物信息學分析

用“zinc”“zinc transporter”或“Zn2+”在野生羊草轉錄組數據庫（本實驗室測定）中篩選注釋為鋅相關的基因，最后篩選到Lc206852。通過植物基因組網站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中BLAST 查找Lc206852的同源蛋白，基于Lc206852 及同源蛋白利用https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw 進行多重比較并構建系統進化發生樹。利用TMHMM（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行跨膜域預測。

1.3 亞細胞定位

將光照培養7 d 的羊草幼苗速凍研磨，利用TransZol Up Plus RNA Kit（北京全式金生物技術有限公司）提取RNA，使用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus） （上海翊圣生物科技有限公司）合成cDNA 并去除基因組DNA。利用引物LcZIP1-GFP_F-5′-CGGGGTACCATGGCAGCAGCCA GTCTCAAG-3′和LcZIP1-GFP_R-5′-CCGCTCGAGGGTGCCCATACGGCAAGCATTGAC-3′（加粗字母為限制性內切酶酶切位點，分別為KpnⅠ和XhoⅠ），使用大連寶生物工程有限公司的PrimeSTAR HS DNA 聚合酶從羊草cDNA 中擴增不含終止密碼子的Lc206852全長編碼序列。通過TA 克隆將PCR 產物連接到pEASYBlunt Simple Cloning Vector（北京全式金生物技術有限公司）后進行測序驗證。將測序正確的Lc206852連接到pENTR 3C（Thermo Fisher）的KpnⅠ和XhoⅠ位點，通過Gateway 克隆將不含終止子的Lc206852連接到植物雙元表達載體pGWB605[23］的花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV）35S 啟動子下游，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）編碼基因上游，最后將pGWB605-Lc206852轉化農桿菌GV3101。將轉基因農桿菌和含內質網標記蛋白ER mcherry CD3-959 的農桿菌（購自擬南芥生物資源中心）共同注射到本氏煙草葉片下表皮[4，24］。同時采用聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）介導法將重組質粒pGWB605-Lc206852轉入羊草葉原生質體[4，25］。

采用蔡司LSM 710 共聚焦顯微鏡（德國）和LSM880 超高分辨率共聚焦顯微鏡（德國）觀察GFP 和mCherry熒光。

1.4 熒光定量PCR

將光照培養7 d 的羊草幼苗移入MQA-CK 液體培養液中，生長14 d 后置于含不同濃度鋅和鐵的MQA-CK 液體培養液中處理2 d。處理液分別為：對照（MQA-CK）、缺鋅（不含Zn2+的MQA，即MQA-Zn2+）、高鋅（MQA+150 μmol·L-1Zn2+）、缺鐵（不含Fe2+的MQA，即MQA-Fe2+）和高鐵（MQA+500 μmol·L-1Fe2+）。參照1.3 分別提取羊草葉和根的總RNA 并合成cDNA。以cDNA 為模板，使用上海翊圣生物科技有限公司的實時熒光定量PCR 試劑盒Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 和TOWER 2.2 熒光定量梯度PCR 儀（德國）進行qRT-PCR 分析，重復3 次。qRT-PCR 擴增引物為LcZIP1-RT_F-5′-CGTCGACACCATCGCCACGG-3′，LcZIP1-RT_R-5′-CACCGAGTGCACTATGATCCCCAGC-3′。以LcACTIN2作為內參，采用2-ΔΔCt算法[4］分析該基因的相對表達量。擴增體系：總體積為20.0 μL，其中Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（1×）：10.0 μL；上游引物（0.2 μmol·L-1）：0.4 μL；下游引物（0.2 μmol·L-1）：0.4 μL；cDNA（200 ng·μL-1）：1 μL；ddH2O：8.2 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40 個循環。熔解曲線程序為60~95 ℃，每15 s 升溫1 ℃。

1.5 酵母功能互補試驗

使用引物LcZIP1-pYUL2_F-5′-GCTCTAGAATGGCAGCAGCCAGTCTCAAGC-3′；LcZIP1-pYUL2_R-5′-CCCAAGCTTTCATGCCCATACGGCAAGCATTGAC-3′（加粗字母分別為XbaⅠ和HindⅢ酶切位點）和PrimeSTAR HS DNA 聚 合 酶（Takara，大 連）將Lc206852克隆入酵母表達載體pYUL2，利 用Yeast Transformation System 2（CLONTECH）轉化高鋅敏感酵母突變體?zrc1/?cot1（BY4741，MATa zrc1：：Ura1 cot1HIS，由華中農業大學林會副教授惠贈）。利用引物LcZIP1-pFL61_F-5′-ATTTGCGGCCGCGGTACC ATGGCAGCAGCCAGTCTCAAG-3′和LcZIP1-pFL61_R-5′-ATTTGCGGCCGCTCATGCCCATACGGC AAGCATTG-3′（加粗字母分別為KpnⅠ和NotⅠ酶切位點）擴增Lc206852，將Lc206852克隆入酵母表達載體pFL61。利用上述方法轉化低鋅敏感酵母突變體?zrt1/?zrt2（ZHY3；MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1：：LEU2 zrt2：：HIS3）和低鐵敏感酵母突變體?fet3/?fet4（DEY1453；MATa can1his3leu2trp1 ura3?fet3：：HIS3?fet4：：LEU2）（由美國Missouri 大學David Eide 教授惠贈）。將轉基因酵母的OD600值調至1.0，然后進行梯度稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4。取10 μL 不同濃度的菌液點樣于含高鋅[（YPD 培養基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，加水定容至95 mL，瓊脂粉2 g，121 ℃滅菌20 min，待溶液冷卻后加入40 %無菌葡萄糖5 mL）+7 mmol·L-1ZnCl2，pH 6.5］、低鋅（YPD 培養基+1 mmol·L-1乙二胺四乙酸+50 μmol·L-1ZnCl2，pH 6.5）和低鐵[（SD-Ura 培養基：Minimal SD Base 2.67 g，-Ura DO Supplement 0.077 g 于蒸餾水中充分溶解，定容至100 mL，瓊脂粉2 g，121 ℃滅 菌20 min）+50 mmol·L-1MES+50 μmol·L-1紅 菲 繞 啉 二 磺 酸 （Bathophenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate，BPDS），pH 為5.5］的酵母培養基上。30 °C 暗培養3~4 d 后觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 Lc206852 同源蛋白系統發育分析和跨膜域分析

通過Phytozome 中的BLAST 分析，發現Lc206852 與擬南芥AtZIP1 同源，因此將其命名為LcZIP1。選取親緣關系較近的禾本科5 屬8 種植物的ZIP1 同源蛋白進行系統發生分析，發現LcZIP1 與禾本科短柄草屬（Brachypodiumspp.）的Brachypodium stacei和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）親緣關系最近（圖1A）。跨膜域分析發現羊草LcZIP1 含347 個氨基酸，有9 個跨膜結構域（transmembrane domain，TM），其中膜內和膜外各有5 個非跨膜域短肽（圖1B）。高粱（Sorghum bicolor）、柳枝稷（Panicum virgatum）、狗尾草（Setaria viridis）、谷子、二穗短柄草和B. stacei含9 個跨膜結構域，羊草LcZIP1 與其結構類似；而哈氏黍（Panicum hallii）與LcZIP1 不同，其只含7 個跨膜域，其中第5 和6 個跨膜域缺失，第4 個跨膜域之后的非細胞質面非跨膜域短肽長度長于LcZIP1（圖1C）。ZIP1 在不同的植物中存在一定程度的變異。

圖1 LcZIP1 同源蛋白系統進化發生分析和跨膜域Fig.1 Phylogenetic analysis and transmembrane domains of LcZIP1 homologues

2.2 LcZIP1 亞細胞定位于內質網

觀察煙草下表皮細胞異源共表達LcZIP1-GFP和內質網標記蛋白發現，LcZIP1 的綠色熒光呈網狀結構，內質網標記蛋白的紅色熒光同樣呈網狀結構，并且綠色熒光和紅色熒光融合，呈黃色熒光，表明在煙草細胞中LcZIP1 定位于內質網（圖2A）。觀察LcZIP1和內質網標記蛋白在羊草葉肉細胞原生質體中的共表達也發現，LcZIP1 的綠色熒光也和內質網標記蛋白的紅色熒光融合（圖2B），表明LcZIP1 定位于羊草葉肉細胞的內質網上。

圖2 LcZIP1 定位于內質網Fig. 2 LcZIP1 was located in endoplasmic reticulum

2.3 LcZIP1 響應高鋅、低鐵和高鐵條件

實時熒光定量PCR 結果表明，LcZIP1在羊草根和葉中均有表達。在缺鋅條件下，LcZIP1在根和葉中的表達量無顯著差異。在高鋅、缺鐵和高鐵條件下，葉中LcZIP1的表達量無顯著變化，但根中LcZIP1的表達量均顯著上調（圖3）。在高鐵條件下，根中的表達量雖然上調但顯著低于缺鐵條件。結果表明，羊草根細胞中的LcZIP1參與對高鋅、低鐵和高鐵條件的響應。

圖3 不同Zn2+和Fe2+濃度條件下LcZIP1 的相對表達量Fig. 3 Relative expression of LcZIP1 under different Zn2+and Fe2+ concentration

2.4 LcZIP1 具有Fe2+轉運功能

在低鐵條件下，LcZIP1能夠恢復低鐵敏感酵母突變體?fet3/?fet4的生長表型，與已報道的陽性對照AtZIP7表型一致（圖4A）。據報道，AtZIP7可以使?fet3/?fet4在低鐵條件下恢復生長[8］，表明其具有鐵轉運功能。

圖4 LcZIP1 在酵母突變體?fet3/?fet4、?zrt1/?zrt2 和?zrc1/?cot1 中的功能互補驗證Fig. 4 Complementation analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants （?zrt1/?zrt2， ?fet3/?fet4 and ?zrc1/?cot1） with LcZIP1

在低鋅條件下，LcZIP1不能恢復低鋅敏感酵母突變體?zrt1/?zrt2（鋅吸收缺陷酵母突變體）的生長表型（圖4B），與已報道的陽性對照AtZIP7（該基因具有鋅轉運功能）不同，因為AtZIP7可以使?zrt1/?zrt2在低鋅條件下恢復正常生長。

在高鋅條件下，LcZIP1不能增強?zrc1/?cot1對高鋅的抗性，所以不能在高鋅培養基上生長（圖4C），與已報道的陽性對照MtMTP3（該基因具有鋅轉運功能）不同。MtMTP3能夠增強?zrc1/?cot1對高鋅的抗性，在高鋅培養基上可正常生長[26］。

以上酵母功能互補試驗表明，LcZIP1具有Fe2+轉運功能，無Zn2+轉運功能。

3 討論

前期研究表明植物ZIP 家族成員由309~476 個氨基酸組成，含8 個跨膜域，氨基端和羧基端位于質膜外，第3 和4 跨膜域之間的短肽長度變異度大，命名為變異區（variable region），該區富含組氨酸，被認為是潛在的金屬結合域[27］。后來發現，水稻OsZIP1 有9 個跨膜域，氨基端位于膜內，羧基端位于膜外[16］，但OsZIP1 的鋅結合域尚未明確；蒺藜苜蓿6 個ZIP 家族成員（MtZIP1， 3， 4~7）由350~372 個氨基酸組成，有8 個跨膜域，第3 和4 跨膜域之間也為富含組氨酸的短肽[11］。本研究發現羊草LcZIP1 由347 個氨基酸組成，含9 個跨膜域，氨基端位于膜內，羧基端位于膜外，與OsZIP1 相似。在高粱、柳枝稷、狗尾草、谷子、哈氏黍、二穗短柄草和B. stacei的ZIP 中除哈氏黍ZIP 有7 個跨膜域，其余都具有9 個跨膜域。另外這些ZIP 的第4和5 跨膜域之間短肽長度變異度大，為54~108 個氨基酸（圖1C）。羊草LcZIP1 第4 和5 跨膜域之間短肽長44 個氨基酸，序列為QRAAHAKKAAAVVGADV EATPAHHAHGVSAAIASSSDAQLIRHR，含5 個組氨酸，其他非跨膜域不含組氨酸。表明這段短肽可能代表金屬結合域，但需進一步證明。此外還發現，以上8 種禾本科植物（包括羊草在內）中，除哈氏黍外，其余植物的ZIP1 都具有9 個跨膜域。另外，8 種植物ZIP1 的氨基端和羧基端都分別位于膜內和膜外（圖1）。

目前已發現植物ZIP 家族可以轉運Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+或Cd2+。這些元素都屬于重金屬，其中絕大多數（Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+和Mn2+）還屬植物生長必需微量元素，因此對該家族成員的挖掘有助于了解Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+和Cd2+對促進農作物生長或富集土壤重金屬的分子機制，也可為農作物的改良和土壤重金屬污染防治提供依據。羊草是內蒙古草原的重要建群種，抗逆性強，不僅是優質的天然牧草還是重要的生態草。羊草ZIP 家族成員的挖掘和功能鑒定，對于了解羊草對必需重金屬（Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+）和非必需重金屬（Cd2+）吸收和轉運的分子調控機理具有重要的理論意義，也為牧草和其他農作物的改良和被重金屬污染的土壤生態修復提供參考。已有研究表明將擬南芥AtZIP1在非洲重要主食木薯（Manihot esculenta）中過表達可顯著提高木薯塊根的鋅含量[28］。將擬南芥ZIP 家族成員IRT1和編碼鐵蛋白（ferritin）的基因FER1在木薯中共表達，田間試驗數據表明轉基因木薯產量不受影響，但Fe 的積累水平提高了7~18 倍，Zn 提高了3~10 倍。該研究為改善全球人口的營養提供了助力[29］。有些ZIP 成員具有金屬解毒的功能，如OsZIP1 定位于內質網和質膜上，在過量的鋅、銅和鎘的條件下，OsZIP1被誘導表達，因此可阻止Zn、Cu 和Cd 在水稻中過量積累[16］。

本研究發現LcZIP1 定位于內質網，高鋅、高鐵和缺鐵條件下，根中的LcZIP1表達上調；酵母功能互補試驗發現，LcZIP1 參與Fe2+轉運，但其是將Fe2+轉運至內質網進行貯存還是排出內質網尚需進行深入研究。另外，現已報道ZIP 家族成員在擬南芥、水稻、小麥、大麥和菜豆中分別有15、17、14、12 和23 個[15］，羊草ZIP 家族中有多少成員還需進一步的研究。