韭菜子皂苷的提取與抗疲勞作用

達熱卓瑪 徐一達 沈 婧

（1.海西州疾病預防控制中心業務科，青海 海西蒙古族藏族自治州，817000；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122）

韭菜子是百合科蔥屬韭（Allium tuberosum Rottler ex Sprengle.）的種子，又名韭子。質硬，氣特異，味微辛[1]。具有溫中、補虛、益陽、調和臟腑的作用[2-4]。被衛生部列為保健品之一，國內外對韭菜子的研究很少，且大多以韭菜子抗菌、抗氧化等為主[5-7]。從我們掌握的文獻資料來看，國外還未對韭菜子進行過甾體皂苷抗疲勞功效方面的研究，國內也鮮有研究。本研究對韭菜子中的皂苷成分進行了提取和鑒別，并探討了其抗疲勞作用，為韭菜子甾體皂苷用于臨床抗疲勞作用提供一定依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

韭菜子：購于安徽亳州藥材市場。實驗動物：昆明小 白鼠［生產企業：上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK (蘇) 2012-0002］，雌雄各半，每只（20±5）g；飼養環境：屏障環境，清潔級（小鼠）。無水乙醇、硫酸、茴香醛、冰醋酸、乙酸乙酯、石油醚（30 ～60℃）、正丁醇等分析純有機試劑（生產企業：國藥集團化學試劑有限公司）；氫化可的松（生產企業：太極集團西南藥業股份有限公司生產，批號：090103）；血乳酸試劑盒（生產企業：艾萊薩生物科技有限公司，批號：E20200101A）；對照品：實驗室分離得到；MCI色譜柱（10150 cm）（生產企業：日本三菱化學公司）。

1.2 儀器與設備

植物粉碎機（生產企業：常州市金球設備有限公司）、旋轉蒸發儀（生產企業：上海申順生物科技有限公司）、循環水式多用真空泵（生產企業：鄭州長城有限公司，型號：SHB-BB型）、恒溫油水浴鍋（生產企業：江蘇金怡儀器科技有限公司，型號：YD2A）、精密電子天平（生產企業：瑞士梅特勒，型號：ME104E）。

2 實驗方法

2.1 韭菜子中皂苷的鑒別

2.1.1 樣品提取

將10 kg干燥的生品韭菜子粉碎，經40目過濾篩，放入提取罐，用6～8倍量50%乙醇回流提取2 h，冷卻，過濾，上清液濃縮干燥至無醇味，上樣 MCI色譜柱（10×150 cm），先用離子水，10%乙醇、45%乙醇、70%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，70%乙醇部位以甾體皂苷為主，鑒于此，收集70%乙醇部位，減壓濃縮干燥待用[8-10]。

2.1.2 樣品定性檢測

醋酐-濃硫酸反應（Liebermann-Burchard），在試管中將

2.1.1 中得到的濃縮物少量溶于乙酸酐，再沿試管壁加入濃硫酸，觀察并記錄[11]。

五氯化銻反應(Kahlenberg)，將少量2.1.1中得到的濃縮物與五氯化銻的氯仿溶液反應，觀察顏色變化。

三氯醋酸反應(Rosen-Heimer)，將2.1.1中得到的濃縮物制成溶液滴在濾紙上，加三氯醋酸試劑一滴，加熱，進行觀察記錄[12]。

2.2 韭菜子中皂苷的提取工藝

2.2.1 測定波長的選擇

取對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混勻使之溶解，得到對照品溶液，其濃度1 mg/mL。

用移液槍精密移取1.5 mL對照品溶液，真空蒸發至干，迅速用移液槍精準加入0.8 mL的高氯酸，0.2 mL的5% 香草醛-冰醋酸，于60 ℃水浴顯色，15 min后流水冷卻，加入5 mL冰醋酸，搖勻，以不加對照品的管為空白，立即在200～800 nm波長下掃描，測定吸光度，記錄數據[13-14]。

2.2.2 標準曲線

取2.2.1配置的對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于10 mL比色管中，揮干溶劑，加高氯酸至刻度，置25 ℃水浴中保溫25 min，取出冷卻至室溫，顯色，得質量濃度分別為0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.012 mg/mL的溶液，以高氯酸為空白試劑，在454 nm處測量吸光度，回歸分析[15-16]。

2.2.3 酒精濃度對皂苷提取率的影響

取6份準確稱定的2 g韭菜子粉末置于5個干燥潔凈150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入50 mL的水及30%、40%、50%、55%、60%乙醇溶液。恒溫60 ℃，靜置1 h過濾，提取3次，測定吸光度。

2.2.4 料液比對皂苷提取率的影響

取5份準確稱定的2 g韭菜子粉末置于5個干燥潔凈150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入12.5 mL、25.0 mL、50.0 mL、100.0 mL、200.0 mL的60%乙醇。恒溫60 ℃震蕩1 h，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.2.5 提取溫度對皂苷提取率的影響

取7份準確稱定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL的60%乙醇，分別控制在恒溫20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下震蕩1 h，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.2.6 提取時間對皂苷提取率的影響

取6份準確稱定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇，分別恒溫60 ℃ 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，靜置過濾，提取3次，取濾液，測定吸光度。

2.3 韭菜子抗疲勞作用

2.3.1 建立陽虛小鼠模型

選取60只小鼠，6周齡，體重20～25 g，雌雄各半，適應性飼養1周，編號后隨機分成3組，每組20只。除空白對照組外，余組肌注氫化可的松25 mg/kg，連續7 d［17-18］。

2.3.2 游泳力竭實驗

造模后，將2.1中的樣品按1 g/kg的劑量與純凈水制成混懸液灌胃治療組，空白對照組、模型組給予等體積純凈水，連續10 d。末次給藥后1 h，取每組10只尾部負重體重10%的鉛絲，投入體積為35 cm×33 cm×20 cm、水溫為（28±1）℃的圓形玻璃缸內，頭部無力游出水面7 s記錄為游泳時間（即抗疲勞時間）；另外每組10只尾部負重體重4%的鉛絲，投入體積為35 cm×33 cm×20 cm、水溫（28±1）℃的圓形玻璃缸中，游泳10 min，休息15 min后眼球采血，測定血清中的乳酸值。

2.4 統計學分析

建立數據庫，應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計量資料用（±s）表示，根據正態分布檢驗方差齊性，選擇單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，組內比較采用最小顯著性差異法（LSD），檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 韭菜子中皂苷的鑒別

醋酐-濃硫酸反應（Liebermann-Burchard），觀察發現呈黃-紅-紫-藍-綠色等變化，最后褪色。

五氯化銻反應（Kahlenberg），將2.1.1中得到的濃縮物少量與五氯化銻的氯仿溶液反應，干燥加熱60 ℃時顯紫色。

三氯醋酸反應（Rosen-Heimer），加熱后濾紙上生成紅色并漸變為紫色。在同樣實驗條件下，三萜皂苷加熱100 ℃才會生成紅色，再變為紫色，而樣品反應更快，加熱至60 ℃即呈紅色，之后變為紫色，由此推測樣品含甾體皂苷。

皂苷水解成苷元、羥基脫水成雙鍵、雙鍵移位、分子間縮合、使脂環上產生共軛雙鍵而與濃硫酸等反應呈現多種不同的色調，或在紫外光下呈現熒光。顯色反應的快慢主要決定于脂環上原來存在的雙鍵的多少、羥基的多少，脂環上原有共軛雙鍵的呈色很快，環上只有孤立雙鍵的呈色慢，完全飽和、羥基又少的不呈色。甾體皂苷的顯色反應比三萜皂苷快，因為三萜脂環上的碳原子甲基取代多而變化稍慢，顯示韭菜子70%洗脫液中含有甾體皂苷。

3.2 韭菜子中皂苷的提取工藝

3.2.1 測定波長的選擇

見圖1，標準品在454 nm附近處出現峰型穩定的次高峰，而韭菜子提取液也在454 nm波長附近出現了峰型單一的次高峰，經多次掃描，峰型穩定，漂移較小，可以認為是同一物質，由此將454 nm作為韭菜子中皂苷的測定波長。

圖1 200～1000nm韭菜子提取液皂苷吸光度曲線

3.2.2 酒精濃度對皂苷提取率的影響

乙醇濃度在0%到50%期間皂苷提取率隨著度數的增加而增大，當50%時提取效果最好，而超過50%后，提取率開始降低，見圖2。

圖2 不同乙醇濃度提取皂苷的提取率

3.2.3 料液比對皂苷提取率的影響

料液比在1:6.25到1:200范圍內，隨著溶劑量的增加，提取率遞增，見表1。料液比越大，表明細胞液與胞外溶劑間的濃度差越大，活性物質的擴散速率也就越快。鑒于后期的濃縮成本及工藝復雜性等因素，在料液比為1:12.5至1:25區間的皂苷提取率趨于平穩。

表1 不同料液比對韭菜子中皂苷提取率的影響

3.2.4 提取溫度對皂苷提取率的影響

見圖3，隨提取溫度的增加，皂苷的提取率顯著上升。這是由于溫度升高皂苷溶于乙醇時吸收熱量,根據平衡移動原理,當溫度升高時,平衡有利于向吸熱的方向移動。在這期間，皂苷的提取率隨溫度升高而增大，但溫度達到60 ℃后提取率開始降低。

圖3 韭菜子不同提取溫度皂苷提取率

3.2.5 提取時間對皂苷提取率的影響

見圖4，提取時間越長，皂苷提取率越高，而4 h之后達到一定的穩定狀態，往后時間對提取率的影響并不大。

圖4 韭菜子在不同提取時間的皂苷提取率

3.2.6 最優條件分析

綜合單因素實驗結果，取六組平行樣品， 測得 在乙醇濃度50%，溫度60 ℃，料液比1:25，提取4 h，韭菜子總皂苷含量的均值為3.28%，見表2。

表2 韭菜子中總皂苷含量測定

3.3 韭菜子甾體皂苷對陽虛模型小鼠的影響

空白組、模型組、治療組在小鼠游泳力竭時間和血乳酸含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），為明確具體差異，經LSD法進行組內比較，得出模型組與空白對照組相比，小鼠游泳力竭時間顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05），模型建立效果理想。治療組與空白組 比較，小鼠游泳力竭時間 有增加，差異有統計學意義（P＜0.05），較模型組顯著延長，差異有統計學意義（P＜0.05）； 模型組與空白組比較，血乳酸含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05），治療組與空白組比較，血乳酸含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），較模型組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 韭菜子甾體皂苷對陽虛小鼠游泳時間和血乳酸（LAC）的影響（±s）

表3 韭菜子甾體皂苷對陽虛小鼠游泳時間和血乳酸（LAC）的影響（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01；1=空白組，2=模型組，3=治療組。

組別只數時間（s）血乳酸（mmol/L）空白細110325.57±36.036.81±0.55模型組210237.78±40.807.74±1.04治療組310375.96±59.656.04±0.84 P＜0.001＜0.001 F 22.495** 10.385**LSD2＜1，3**；3＞1*，3＞2**2＞1*，3**；3＜1*，3＜2**

4 討論

韭菜子提取物抗菌、抗氧化、抗疲勞作用已有大量文獻報道[19-20]。為進一步明確韭菜子中抗疲勞的具體有效成分，此次研究將韭菜子提取物進一步分離，通過顯色反應，鑒定韭菜子中的皂苷為甾體皂苷，并分析了不同酒精濃度、料液比、溫度及提取時間對皂苷提取率的影響， 發現在50%乙醇，60 ℃，料液比1:25，提取4 h條件下韭菜子總皂苷含量的均值為3.28%，是最佳提取工藝條件。動物實驗結果顯示：模型組小鼠與空白對照組相比，小鼠游泳力竭時間顯著減少 （P＜0.05）且血乳酸含量增加（P＜0.05），證明建模效果良好。 治療組小鼠游泳力竭時間較模型組和空白組明顯延長（P＜0.05），且治療組小鼠血乳酸含量顯著低于模型組（P＜0.05），提示 韭菜子甾體皂苷能顯著降低小鼠運動過程中的乳酸堆積，從而緩解小鼠體力疲勞，提高小鼠的運動耐力，這與陶永梅[20]、閆東[21]的研究結果一致。韭菜子甾體皂苷降低血乳酸水平的機制主要考慮兩個方面：根據《羅氏會約醫鏡》[22]中記載韭菜子入肝經、腎經，現代也有文獻研究其有溫補肝腎的作用,韭菜子中的甾體皂苷通過改善肝、腎功能，升高 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶，促進小鼠體內的乳酸更快轉變為葡萄糖或糖原[23-24]；二是通過降低MDA、NO含量，提高肝臟中T-SOD、GSH-PX 酶活力，使小鼠在相同強度的運動中可以利用更多的氧氣，運動肌就會有更多的血氧供應，從而加速肌肉對乳酸的代謝，減少乳酸堆積。

韭菜是一種適應力極強的植物，在我國西部高海拔地區也有廣泛種植，極具開發價值，希望通過以上研究能夠為下一步研究開發韭菜子甾體皂苷類中藥新藥提供理論參考，使韭菜子食藥領域得到更廣闊的應用。另外，由于 分離工作量較大且耗時，單體化合物的藥理活性和構效關系有望在今后得到進一步研究。