天然復合抗菌材料Car-CTAB/MMT 的制備、表征及抑菌活性研究

郭佳彥，何秋蓉，麻曉霞，高靈娟

（寧夏大學化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，寧夏銀川 750021）

天然抗菌劑是從天然物質中提取，最早利用的一種抗菌劑，根據(jù)來源不同，可以分為動物源、微生物源和天然植物源抗菌劑等[1]。其中，天然植物源抗菌劑由于材料易得，富含抑菌成分，成為開發(fā)新型天然抗菌劑的熱門取材。精油中的香芹酚具有高效、低毒、安全穩(wěn)定、選擇性高、不易產生抗藥性等優(yōu)點[2]，對細菌、酵母菌、真菌、昆蟲及螨類均具有良好的生長抑制作用[3-5]。但香芹酚水溶性差、易揮發(fā)限制了其應用范圍[6]。

固定化抗菌劑改善了其溶解性，是延長抗菌效果的有效方法[7]，通常可通過載體材料固定抗菌劑[8]。蒙脫石是一類天然的黏土礦物質，價格低廉，孔隙率高，理化性質穩(wěn)定，具有較強的離子交換能力，成為了抗菌材料載體的優(yōu)良選擇[9]。有機改性蒙脫石可增大晶片層間距離，并使其表面由親水性變?yōu)槭杷浴；谝陨希狙芯繉⑾闱鄯迂撦d于有機改性蒙脫石上，制備一種新型復合抗菌材料Car-CTAB/MMT，探究其穩(wěn)定性，分析其抗菌性能及活性，拓寬其應用范圍。

1 材料

蒙脫石（山東優(yōu)索化工科技有限公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；香芹酚（Car，99%，上海麥克林生化科技有限公司）；大腸桿菌（ATCC 25922，國家微生物保藏中心）。

2 實驗方法

2.1 Car-CTAB/MMT 的制備

將10 g 蒙脫石置于200 mL 去離子水中，80 ℃下攪拌30 min，加入1 倍CEC 量的CTAB 振蕩并加熱3 h，冷卻到25 ℃，離心，洗滌，干燥，研磨后得CTAB/MMT（十六烷基三甲基溴化銨/蒙脫石）。

稱取3 g CTAB/MMT 于150 mL 容量瓶中，加入70 mL 蒸餾水，在60 ℃下振蕩1 h，稱取2 g 香芹酚溶于60 mL 無水乙醇中，再加入CTAB/MMT 懸浮液中，繼續(xù)振蕩24 h，隨后50%乙醇溶液離心洗滌3 次，干燥后即得Car-CTAB/MMT。

2.2 Car-CTAB/MMT 的表征

物相分析采用島津-XRD 6000 X-射線衍射儀。紅外光譜分析采用PE Spectrum 2000 型紅外光譜儀。使用SEM，JSM-7500F 掃描電子顯微鏡觀察樣品改性前后結構形貌變化及有無團聚情況。采用分光光度法測定蒙脫石中負載的香芹酚或百里香酚含量[10]。

2.3 抑菌活性及機理研究

2.3.1 Car-CTAB/MMT 的MIC 及MBC 測定 采用抑菌圈法[11]和標準肉湯稀釋法[12]測定對大腸桿菌的抑菌圈直徑、MIC 及MBC 來評估Car-CTAB/MMT 的抗菌性能。

2.3.2 生長曲線的測定 將大腸桿菌接種到100 mL新鮮制備并滅菌的細菌液體培養(yǎng)基中，分別向培養(yǎng)基中加入0.25×MIC、0.50×MIC 和1.00×MIC 的Car-CTAB/MMT，不加Car-CTAB/MMT 的設置為對照組，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱的條件下進行培養(yǎng)（100 r/min），每隔2 h 取樣。在紫外可見分光光度計中，測定其光密度值（λ=600 nm）（OD 值），分析大腸桿菌的生長曲線。

2.3.3 掃描電鏡觀察細菌形態(tài)變化 將大腸桿菌培養(yǎng)到對數(shù)期后，加入Car-CTAB/MMT，使其濃度達到MBC，在培養(yǎng)箱中振蕩（37 ℃，100 r/min）12 h，每2 h取樣1 次。用磷酸鹽緩沖液清洗樣品3 次，冷凍離心分離（5 000 r/min，10 min）后，用2.5%戊二醛溶液在4 ℃下反應12 h，再用磷酸鹽緩沖液清洗樣品3 次，用5%、25%、50%、75%、95%、100%的乙醇溶液逐級洗脫后，冷凍離心分離（4 ℃，5 000 r/min，10 min），干燥。樣品經噴金處理后在掃描電鏡下觀察。

2.3.4 堿性磷酸酶及細胞滲漏的測定 通過使用酶試劑盒檢測細胞外堿性磷酸酶（AKP）活性的變化來反映細菌細胞壁的通透性變化。通過酶試劑盒測量細胞成分（蛋白質和核酸）的釋放來確定細胞膜的完整性。

3 結果與討論

3.1 負載香芹酚和百里香酚含量

在最大的吸收波長275 nm 下，香芹酚的標準曲線為A=0.014 4C+0.001 9，相關指數(shù)R2=0.998 1。這說明香芹酚的濃度與吸光度之間具有良好的線性關系。Car-MMT 和Car-CTAB/MMT 中香芹酚的含量分別為8.24%和13.42%，表明CTAB 改性蒙脫石提高了蒙脫石對香芹酚的負載率，因為CTAB 分子中的長碳鏈烷基具有良好的親油性[13]，可提高蒙脫石對有機物的富集能力。

3.2 紅外光譜結果分析

材料的紅外光譜對比圖見圖1。由圖1 可知，負載香芹酚前后CTAB/MMT 的紅外光譜峰形基本一致，均出現(xiàn)了蒙脫石的特征吸收峰：3 624.55 cm-1處的吸收峰為Al-O-H 中羥基伸縮振動吸收峰，1 031.99 cm-1處為蒙脫石晶格中八面體Si-O-Si 的伸縮振動吸收峰，800～400 cm-1處為Al-O 和Si-O 的彎曲振動吸收峰，3 430.41 cm-1和1 642.79 cm-1處的吸收峰分別為層間結構水羥基O-H 的伸縮振動吸收峰和彎曲振動吸收峰。2 925.41 cm-1和2 853.19 cm-1處的吸收峰是由于CTAB 中CH2和CH3基團的伸縮振動。通過比較譜線可以看出，與CTAB/MMT 對比，Car-CTAB/MMT紅外光譜圖發(fā)生了以下變化：3 019.14 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)C-H 的伸縮振動吸收峰；1 591.05、1 514.39、1 418.93 cm-1處為苯環(huán)的碳骨架振動；1 381.03 cm-1處出現(xiàn)了CH3的彎曲振動峰。

圖1 Carvacrol、CTAB/MMT 和Car-CTAB/MMT 的紅外光譜圖

3.3 Car-CTAB/MMT 抑菌圈和MIC 及MBC 的測定結果分析

MMT 和Car-CTAB/MMT 的抑菌圈測試結果見圖2。純蒙脫石對大腸桿菌沒有抑制效果（圖2a），與文獻一致[14]；改性后Car-CTAB/MMT 抑菌圈的直徑約為4 mm，說明Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌具有良好的抑制效果。

圖2 抑菌圈測試結果

通過相同質量香芹酚對大腸桿菌的MIC 和MBC測定可知，游離態(tài)香芹酚的MIC 和MBC 為125.0 μg/mL和250.0 μg/mL，而Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌的MIC和MBC 分別為62.5 μg/mL 和125.0 μg/mL。明顯固定到載體上的香芹酚比游離態(tài)時抑菌活性高，Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

3.4 Car-CTAB/MMT 對細菌生長曲線的影響

培養(yǎng)液的OD 值變化可說明Car-CTAB/MMT 對細菌抑制作用的大小（圖3）。由圖3 可知，隨著Car-CTAB/MMT 濃度的增大，Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌生長曲線發(fā)生明顯變化。當添加了0.25×MIC 和0.50×MIC 的Car-CTAB/MMT 后，OD 值隨時間的延長而升高，說明Car-CTAB/MMT 可以有效抑制大腸桿菌的生長；當菌液中添加1.00×MIC 的Car-CTAB/MM 后，OD值（λ=600 nm）無明顯變化，說明在該濃度下，大腸桿菌無增殖現(xiàn)象。

圖3 Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌生長曲線的影響

3.5 Car-CTAB/MMT 抗菌機理研究

3.5.1 Car-CTAB/MMT 對細菌形貌的影響 Car-CTAB/MMT 與大腸桿菌共培養(yǎng)10 h 前后細菌形態(tài)掃描電鏡圖見圖4。由圖4 可以看出，對照組未出現(xiàn)細胞破損現(xiàn)象，當二者共培養(yǎng)處理2 h 后，大腸桿菌發(fā)生變形，部分粘連在一起。隨著處理時間的延長，菌體發(fā)生聚集，表面出現(xiàn)褶皺、凹陷，且邊界逐漸模糊。處理10 h后，菌體呈現(xiàn)出明顯的不完整形態(tài)，這說明Car-CTAB/MMT 破壞細菌的細胞結構，導致細菌形態(tài)發(fā)生變化，從而達到抗菌作用。

圖4 Car-CTAB/MMT 處理大腸桿菌的掃描電鏡圖

3.5.2 Car-CTAB/MMT 對細胞壁通透性的影響 堿性磷酸酶（AKP）存在于細胞壁與細胞膜之間，無法透過細胞壁滲透到培養(yǎng)液中[15]。若細胞壁被破壞，AKP 會滲透到培養(yǎng)液中，因此，可通過分析AKP 濃度的變化來探究細菌細胞壁受損情況（圖5）。由圖5 可知，未加Car-CTAB/MMT 的培養(yǎng)液中，AKP 濃度維持在5.5 U/L左右，但在加入Car-CTAB/MMT 1 h 后，培養(yǎng)液中AKP濃度上升到13.6 U/L。隨著時間的延長，加入Car-CTAB/MMT 的兩組培養(yǎng)液中AKP 的濃度均明顯高于對照組，說明Car-CTAB/MMT 破壞了細菌細胞壁的完整性。

圖5 Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌AKP 的影響

3.5.3 Car-CTAB/MMT 對細胞膜滲透性的影響 Car-CTAB/MMT 對細菌核酸及蛋白質滲漏的影響見圖6、圖7，由圖6、圖7 可知，經Car-CTAB/MMT 處理后，菌懸液在260 nm 和595 nm 處的OD 值均隨時間的延長而升高，說明培養(yǎng)液中細菌核酸和蛋白質濃度隨時間的延長而變大，大腸桿菌與Car-CTAB/MMT 共培養(yǎng)處理后發(fā)生內溶物滲漏，隨著時間的延長，蛋白質和核酸的滲漏量不斷增加。從圖中可以看出，Car-CTAB/MMT的加入量與蛋白質和核酸的滲漏量成正比。這表明Car-CTAB/MMT 可對細胞膜造成損傷，且加入的量越多，損傷程度越大，這種損傷導致細胞成分滲漏到體外的培養(yǎng)液中，從而使培養(yǎng)液中細胞滲漏物的濃度增高，且隨著時間的延長細胞膜損傷程度不斷增加。

圖6 Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌核酸的影響

圖7 Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌蛋白質的影響

4 結論

以CTAB 改性蒙脫石為載體，負載Car，制備了一種新型復合抗菌材料Car-CTAB/MMT，通過含量測定、紅外表征說明，Car 成功負載在CTAB/MMT 上，且負載量為13.42%。Car-CTAB/MMT 對大腸桿菌有較好的抑菌活性，MIC 和MBC 分別為62.5 μg/mL 和125.0 μg/mL。抑菌機理研究表明，Car-CTAB/MMT 破壞了細菌細胞形態(tài)，損壞了細胞壁結構，細胞通過性和細胞膜滲透性均增加，細胞內蛋白質和核酸發(fā)生泄漏，從而實現(xiàn)了抗菌目的。