雙酶協(xié)同對(duì)煙梗提取物中淀粉降解效應(yīng)的研究

劉恩芬，趙曉晨，周國(guó)福，王 軍，何聲寶

（1.云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司，云南 昆明 650001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，云南 昆明 650032；4.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450001）

0 引言

目前，造紙法再造煙葉在卷煙原料配方中應(yīng)用較廣泛［1］，其除了具有填充值較高、機(jī)械加工力度好、成絲率高、燃燒速度較快、產(chǎn)生的焦油量較低等優(yōu)點(diǎn)外，還可根據(jù)煙草原料配方實(shí)際需要調(diào)整造紙法再造煙葉的物理性能以及化學(xué)指標(biāo)，使其起到功能性原料等多種作用［2］。但不足之處在于再造在煙葉加工過程中需要加入一定量煙梗提取物——梗膏，其中含有較高質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的淀粉、蛋白質(zhì)和果膠等大分子物質(zhì)［3］，會(huì)給產(chǎn)品抽吸品質(zhì)帶來較大的負(fù)向作用，如淀粉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)高易導(dǎo)致煙草燃燒不充分，其煙氣會(huì)帶來刺激、嗆咳感，同時(shí)會(huì)增加焦油釋放量［4］，淀粉在高于600 ℃燃燒時(shí)還會(huì)生成部分稠環(huán)芳烴，如萘、萘酚、蒽和芴酮等［5］。這不僅制約了煙梗提取物在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用，也是目前造成再造煙葉生產(chǎn)企業(yè)煙梗物料過剩的重要原因。駱莉等［6］對(duì)廢次煙葉進(jìn)行了加酶萃取，相比于傳統(tǒng)水溶液萃取，其水溶物萃取效率提高了21.2%；通過對(duì)酶提取液中還原糖和揮發(fā)性成分分析發(fā)現(xiàn)，因酶解導(dǎo)致的葡萄糖等還原糖總量增加了15.4%，石油醚浸提致香成分總量增加了46.9%。通過酶提取廢次煙葉提取物對(duì)卷煙加香評(píng)析表明，酶法萃取煙葉碎片提取物能增加煙香、降低刺激性、掩蓋雜氣。林登銓［7］以淀粉、果膠及木聚糖復(fù)合酶為發(fā)酵載體，采用三級(jí)逆流提取方式對(duì)碎片原料進(jìn)行酶解萃取，萃取率比原有工藝提高了10.4%。通過比較該方法處理前、后所得萃取液涂布制作的再造煙葉評(píng)吸效果顯示，經(jīng)復(fù)合酶處理過的萃取液品質(zhì)較原有工藝有一定提高，說明適當(dāng)?shù)拿附饧夹g(shù)對(duì)提升煙草品質(zhì)具有積極的貢獻(xiàn)。姚光明等［8］發(fā)現(xiàn)，向煙葉中施加α-淀粉酶和糖化酶可使煙葉中的淀粉降解為水溶性糖，能有效改善煙葉質(zhì)量。胡耀輝等［9］以普通玉米淀粉為原料，分別用α-淀粉酶和普魯蘭酶降解淀粉，研究結(jié)果表明此2種酶在降解淀粉方面均具有較好的實(shí)用效果。但目前對(duì)于梗膏這種復(fù)雜基質(zhì)中酶解淀粉狀況的研究仍然比較缺乏。因此，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用需求，為提高煙梗提取液在生產(chǎn)實(shí)際中的使用量，降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，提升再造煙葉在煙草配方中使用的配伍性，利用不同體系生物酶降解煙梗提取液中的淀粉，分析再造煙葉煙梗提取液中淀粉降解情況以及還原糖的增加量，旨在為提高再造煙葉吸味品質(zhì)提供參考，在一定程度上解決生產(chǎn)企業(yè)煙葉和煙梗原料應(yīng)用失衡問題，為緩解企業(yè)排污壓力提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：煙梗提取物（云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司）；α-淀粉酶（酶活力為23000 U/g，武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司）；糖化酶（酶活力為290000 U/g，山東隆科特酶制劑有限公司）；普魯蘭酶（酶活力為20000 U/g，山東隆科特酶制劑有限公司）；超純水（18.2 MΩ，自制）；其他試劑均為市售分析純。

試驗(yàn)儀器：ICS 5000+賽默飛離子色譜儀、CarboPacTMPA10糖柱（美國(guó)Thermo科技有限公司）；ASE-12固相萃取儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；ASE-12固相萃取儀（配Cleanert-S型C18小柱，500 mg/6 mL，美國(guó)Agela科技有限公司）；水系IC針式過濾器（0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；FA1104B電子天平（感量0.0001 g，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-88水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；SHB-Ⅲ真空抽濾機(jī)（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；MILLI-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.0001 g）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容至100 mL，得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水定容至25 mL，準(zhǔn)確移取該溶液0.050、0.125、0.250、0.500、1.000 mL 至試管，分別用超純水稀釋并定容至5 mL，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，溶液濃度分別為0.4、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L。用離子色譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中的葡萄糖濃度，并對(duì)峰面積與其濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到工作曲線方程。

1.2.2 不同酶體系效果比較 為便于研究α-淀粉酶與糖化酶、普魯蘭酶協(xié)同作用的效果，將2種組合酶體系分別與α-淀粉酶單酶體系酶解效果進(jìn)行對(duì)比。分別選擇生產(chǎn)工藝應(yīng)用要求的淀粉降解率為25%和50%時(shí)所需的α-淀粉酶酶量、糖化酶量、普魯蘭酶量，以及對(duì)該條件下生成的葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較。

1.2.2.1 α-淀粉酶單酶體系 取25 g煙梗提取物，分別添加0、30、50、100、200、300、400、500、600 U/g的α-淀粉酶，在70 ℃下減壓濃縮2.5 h（與工生產(chǎn)工藝中濃縮煙梗提取液的時(shí)間保持一致）。然后用超純水定容至25 mL容量瓶中，分別對(duì)淀粉和葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2 α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系 取25 g煙梗提取物，添加365 U/g α-淀粉酶，再分別添加500、600、700、800、900、1000 U/g糖化酶，在70 ℃下減壓濃縮2.5 h，再用超純水定容至25 mL容量瓶中。分別測(cè)定淀粉和葡萄糖的濃度，并擬合出淀粉降解率與加酶量變化的回歸分析方程。

1.2.2.3 α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系 取25 g煙梗提取物，添加365 U/g的α-淀粉酶，再分別添加500、600、700、800、900、1000 U/g普魯蘭酶，在70 ℃下減壓濃縮2.5 h，再用超純水定容至25 mL。分別測(cè)定淀粉和葡萄糖的濃度，并擬合出淀粉降解率與加酶量變化的回歸分析方程。

1.2.3 煙梗提取物中淀粉及葡萄糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)

1.2.3.1 淀粉 （1）乙醇超聲提取去除水溶性糖、色素及酚類物質(zhì)。取1.5 g制備好的煙梗提取物，加入25 mL 85%乙醇超聲30 min，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，除去上清液，重復(fù)2次。沉淀用冷水反復(fù)洗滌，并向上清液中加入3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴共熱5 min后，如果溶液不顯色，表明濾渣中可溶性糖已去除干凈。

（2）酶解煙梗提取物樣品。向沉淀中加入50 mL pH值約為5.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液及適量2000 U/g的α-淀粉酶，60 ℃恒溫水浴水解2.5 h；之后加入50 mL pH值約為4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液及10000 U/g的糖化酶，60 ℃恒溫水浴水解1.5 h，待冷卻后抽濾，洗滌殘余物，合并濾液，用超純水定容至200 mL。吸取0.1 mL該溶液，用超純水定容至25 mL，將酶解液經(jīng)過ASE-12固相萃取儀Cleanert-S型C18小柱除去雜質(zhì)，再經(jīng)過水系IC針式過濾器過濾后，進(jìn)行離子色譜分析。

脈沖安培-離子色譜檢測(cè)條件：檢測(cè)方式為脈沖安培-糖波形；色譜柱為PA-10糖柱；柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；流動(dòng)相為超純水(A)+250 mmol/L的NaOH溶液(B)；淋洗液梯度洗脫程序?yàn)?～13 min，80% A+20% B(v:v)。

去除煙草浸提物中的水溶性糖，加入淀粉酶后將其中的淀粉分解成葡萄糖，通過測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，折算淀粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)：

式（1）中：W淀粉為淀粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)；W葡萄糖為酶解后葡萄糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)；0.9為葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)換算為淀粉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的換算系數(shù)。淀粉由葡萄糖分子間脫水鏈接形成，葡萄糖的分子量為180，水的分子量為18（為葡萄糖的0.1倍），所以公式（1）中的換算系數(shù)為0.9。

1.2.3.2 葡萄糖 準(zhǔn)確稱取1.000 g的煙梗提取物，用超純水定容至100 mL。準(zhǔn)確移取1 mL該溶液，用超純水定容至100 mL，通過C18小柱凈化后，再經(jīng)過水系濾膜過濾，用離子色譜法［10］分析，分析條件同1.2.3.1節(jié)中離子色譜檢測(cè)。

1.2.3.3 擬合回歸分析方程 根據(jù)工作曲線方程，計(jì)算并擬合出淀粉降解率隨加酶量變化的回歸分析方程：

式（2）中：P為淀粉降解率(%)；W酶解前為煙梗提取物中淀粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)；W酶解后為酶解后梗膏中淀粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

用離子色譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液中的葡萄糖濃度曲線如圖1所示。在一定濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量濃度(x)與色譜峰相對(duì)峰面積(y)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程：y=1.6432x-0.0431，R2=0.9991，線性范圍為0.4～8.0 mg/L，回收率為98.2%～103.9%，說明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性良好。分別按照3和10倍信噪比(S/N=3，S/N=10）計(jì)算的葡萄糖檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為1.0和3.0 mg/g。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單雙酶體系淀粉酶解效果及葡萄糖生成量

2.2.1 單雙酶體系的酶用量

2.2.1.1 α-淀粉酶單酶體系的酶用量 以提取液淀粉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算不同酶用量條件下的淀粉降解率（圖2），并擬合出淀粉降解率隨加酶量變化的回歸分析方程：y=8.4369lnx-24.7360，R2=0.9812。由回歸分析方程可預(yù)測(cè)，當(dāng)?shù)矸劢到饴蕿?5%時(shí)，約需365 U/g的α-淀粉酶；當(dāng)?shù)矸劢到饴蕿?0%時(shí)，約需7397 U/g的α-淀粉酶，酶用量明顯增加。將酶用量添加至樣品中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-淀粉酶添加量為365 U/g時(shí)，淀粉降解率的測(cè)定值為24.47%，與預(yù)測(cè)值(25%)無顯著性差異，降解效果較好；當(dāng)α-淀粉酶添加量為7397 U/g時(shí)，測(cè)得淀粉的降解率為45.48%，與預(yù)測(cè)值(50%)存在顯著性差異。

圖2 淀粉降解率與α-淀粉酶用量的關(guān)系

2.2.1.2 α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系的酶用量 以煙梗提取物淀粉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)，當(dāng)α-淀粉酶的使用量為365 U/g時(shí)，擬合出淀粉降解率隨加糖化酶量變化的回歸分析方程：y=-5.0×10-6x2+0.0472x+12.490，R2=0.9799，見圖3。由上述回歸分析方程可知，當(dāng)?shù)矸劢到饴市枰_(dá)到50%時(shí)，約需使用901 U/g的糖化酶。將以上用量的酶添加至樣品中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得淀粉降解率為51.74%，與預(yù)測(cè)值無顯著性差異。

圖3 淀粉降解率與α-淀粉酶+糖化酶用量的關(guān)系

2.2.1.3 α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系的酶用量 由圖4可知，以煙梗提取物淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)，當(dāng)α-淀粉酶的使用量為365 U/g時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)擬合出淀粉降解率隨普魯蘭酶用量變化的回歸分析方程：y= -9.0×10-5x2+0.183x-39.969，R2=0.9824。由上述回歸分析方程可得，當(dāng)α-淀粉酶添加量為365 U/g時(shí)，淀粉降解率為50%時(shí)，約需815 U/g普魯蘭酶。將以上用量的酶添加至樣品中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得淀粉降解率為48.93%，與預(yù)測(cè)值無顯著性差異。

圖4 淀粉降解率與α-淀粉酶+普魯蘭酶用量的關(guān)系

2.2.1.4 單酶體系與雙酶體系酶解淀粉效果的比較 （1）淀粉酶解率。α-淀粉酶、糖化酶和普魯蘭酶是水解淀粉非常重要的酶，通常使用α-淀粉酶復(fù)合糖化酶或普魯蘭酶酶解淀粉的效率優(yōu)于單酶體系的［11］。通過對(duì)不同雙酶體系或僅使用α-淀粉酶對(duì)煙梗提取液中淀粉的降解效果比較（表1）可知，在相同的淀粉降解率（50%）下，α-淀粉酶+糖化酶、α-淀粉酶+普魯蘭酶的酶活單位使用總量遠(yuǎn)低于僅使用α-淀粉酶的用量，α-淀粉酶與糖化酶、普魯蘭酶均具有協(xié)同酶解淀粉的作用［12］。α-淀粉酶在添加量高達(dá)7032 U/g時(shí)，淀粉降解率僅為45.48%，這是因?yàn)閱蚊阁w系中α-淀粉酶雖能水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，但不能有效地水解α-1,6-糖苷鍵［13］，同時(shí)該酶無法對(duì)其產(chǎn)生的糊精、低聚糖等進(jìn)行充分水解，因此酶解反應(yīng)易受到產(chǎn)物濃度抑制，淀粉酶解效率不高。

由圖5可知，在α-淀粉酶的使用量為365 U/g條件下，當(dāng)糖化酶、普魯蘭酶用量高于600 U/g后，α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系對(duì)應(yīng)的梗膏中淀粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)低于α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系的。這是因?yàn)槠蒸斕m酶可以水解梗膏中支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1，6-糖苷鍵［14-15］，同時(shí)將最小單位的支鏈分解，并使α-淀粉酶得以快速降解成直鏈淀粉，產(chǎn)生更多的低聚糖。綜上，雙酶體系酶解淀粉的協(xié)同酶解效果高于單酶體系的，且當(dāng)α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系在使用量高于600 U/g后，對(duì)淀粉的酶解效率更高。

（2）葡萄糖生成量。由表2可知，在相同的淀粉降解率（50%）下，雙酶體系葡萄糖的生成量高于單酶體系葡萄糖的生成量(P＜0.05)，這與α-淀粉酶無法徹底水解低聚糖有關(guān)［16］，酶解后有一部分淀粉未完全水解為葡萄糖，而是以低聚糖或糊精的形式存在，因此生成葡萄糖的效率低。由圖6可知，在α-淀粉酶的使用量為365 U/g條件下，協(xié)同使用糖化酶、普魯蘭酶時(shí)，α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系條件下葡萄糖生成的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)均高于α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系的。這可能是因?yàn)樘腔改軓牡矸邸⒑⒌途厶堑姆沁€原性末端水解α-1，4-糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，α-淀粉酶為糖化酶不斷提供新的非還原末端，提高了糖化酶的底物濃度，使得糖化酶可以催化生成葡萄糖，因此糖化酶與α-淀粉酶協(xié)同作用可以大幅度提高葡萄糖的生成量；而普魯蘭酶水解淀粉的部分產(chǎn)物為麥芽三糖等低聚糖，α-淀粉酶水解低聚糖緩慢，所以該體系的酶解產(chǎn)物可能仍有一部分以低聚糖的形式存在于梗膏中。因此，由α-淀粉酶與糖化酶組成的雙酶酶解體系生成葡萄糖的效果更好。

表2 單酶體系與雙酶體系酶解淀粉生成葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的比較

圖6 梗膏中葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)與雙酶體系酶用量的關(guān)系

2.3 單雙酶體系酶解效果分析

通過研究表明，α-淀粉酶+糖化酶和α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系降解淀粉的效果明顯強(qiáng)于α-淀粉酶單酶體系的（表2）。在煙梗提取液中淀粉降解率為50%的情況下，單酶體系酶總用量為7397 U/g α-淀粉酶，α-淀粉酶+糖化酶體系共需要1266 U/g酶，α-淀粉酶+普魯蘭酶體系共需1180 U/g酶。α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系酶用量最少，說明普魯蘭酶的應(yīng)用對(duì)降解大分子淀粉有明顯的協(xié)同作用，雙酶體系降解效果優(yōu)于單酶體系。酶為一種蛋白質(zhì)活性物質(zhì)，在滿足需求的情況下，應(yīng)盡可能少加入酶品種和酶活量，以免給再造煙葉產(chǎn)品的感官品質(zhì)帶來不利影響。在降解率基本相同的情況下，單酶體系α-淀粉酶的用量明顯高出其他2個(gè)雙酶體系的。實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，在滿足生產(chǎn)需求的條件下，降解煙梗提取物中的淀粉可優(yōu)先選擇雙酶體系。

3 討論與結(jié)論

與α-淀粉酶不同，普魯蘭酶是專一性的淀粉脫支酶，能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支中的α-1，6-糖苷鍵，其能切下整個(gè)支鏈淀粉分支包括最小單位的分支，形成直鏈淀粉，最大限度地利用淀粉原料［17］。淀粉經(jīng)過普魯蘭酶脫支處理后，淀粉顆粒的微觀結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，形成較多的短鏈淀粉分子。本研究中，當(dāng)魯蘭酶用量高于600 U/g時(shí)，α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系對(duì)應(yīng)的淀粉降解率高于α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系的，所以在酶用量較高時(shí)，α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系酶解梗膏中淀粉的效果更好。

糖化酶能把淀粉從非還原糖端水解α-1,4-葡萄糖苷鍵并逐個(gè)釋放出單個(gè)β-D-葡萄糖，此外還能水解α-1,6-葡萄糖苷鍵和α-1,3-糖苷鍵，將梗膏中的支鏈淀粉徹底水解為葡萄糖［18］，這也解釋了本研究中α-淀粉酶+糖化酶體系在降解淀粉的同時(shí)能增加更高的葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的現(xiàn)象。綜上，本研究中α-淀粉酶+糖化酶體系在降解淀粉的同時(shí)增加葡萄糖生成量的效果較優(yōu)。

煙梗提取物在淀粉降解率相同的情況下，α-淀粉酶+普魯蘭酶和α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系的酶用量遠(yuǎn)低于α-淀粉酶單酶體系。在α-淀粉酶酶用量相同的情況下，α-淀粉酶+普魯蘭酶雙酶體系中普魯蘭酶用量高于600 U/g時(shí)，降解淀粉的效果優(yōu)于α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系的；α-淀粉酶+糖化酶雙酶體系通過降解煙梗提取物中的淀粉并增加葡萄糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的效果更突出。