香根草組織培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑優(yōu)化研究

單芹麗，屈云慧，汪國鮮，吳麗芳，方洪兵，楊春梅*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604）

0 引言

香根草（Vetiveria zizanioides）是禾本科巖蘭屬多年生草本植物，原產(chǎn)于印度尼西亞、印度、斯里蘭卡和緬甸等熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。20世紀(jì)50年代開始進(jìn)入中國［2］，在江蘇、廣東、浙江、山東、四川、福建和廣西等地均有種植和應(yīng)用［1］。香根草地上部分密集叢生，質(zhì)硬，適應(yīng)能力強(qiáng)，能適應(yīng)各種土壤環(huán)境，對生長條件要求不高，其在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬和干旱、漬水、貧瘠、重金屬和污染、貧瘠等環(huán)境條件下都能夠生長［3］，因此，香根草在華東、華南和西南等16個省（市、區(qū)）廣泛種植，用于治理水土流失［4］。此外，香根草根葉片里芳香油含量豐富，可作為調(diào)味劑、香精和化妝品制作的主要原料，該芳香成分還具有驅(qū)蟲、殺菌等功效，可用于防治病、蟲、鼠害。同時，香根草還是工業(yè)造紙、飼料開發(fā)、食用菌培育和工藝編制的原料［2-6］。近年來，香根草在固土護(hù)坡［7］、環(huán)境修復(fù)治理［8-12］、土壤改良［13］等方面發(fā)揮著越來越大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

隨著對香根草進(jìn)一步的開發(fā)與利用，人們對香根草種苗的需求也越來越大。國內(nèi)繁殖香根草的方法主要有分蘗繁殖法、留母株繁殖法、扦插繁殖法、插條繁殖法、切頂繁殖法和縱剖繁殖法等［14］。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行香根草繁殖能在短期內(nèi)培育大量性狀一致的種苗。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)植物生長調(diào)節(jié)劑對植株的生長發(fā)育具有明顯的調(diào)節(jié)作用［15-17］。

前人對植物生長調(diào)節(jié)劑在香根草組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究雖然取得了一些進(jìn)展，但各研究對植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度選用上存在較大差異［18-22］，導(dǎo)致植物生長調(diào)節(jié)劑在規(guī)模化應(yīng)用于香根草種苗生產(chǎn)時，缺乏科學(xué)的理論依據(jù)和具有實踐價值的指導(dǎo)性參考。因此，有必要深入研究植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生長的影響，并對香根草組織培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度進(jìn)行優(yōu)化。鑒于此，本試驗在香根草各組織培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基中添加不同種類和不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，研究植物生長調(diào)節(jié)劑在香根草組培生長中的影響情況，明確植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草各培養(yǎng)階段組培苗生長的作用大小（即主次關(guān)系），同時篩選出適宜各培養(yǎng)階段的植物生長調(diào)節(jié)劑配方，以期為合理使用植物生長調(diào)節(jié)劑，高效生產(chǎn)香根草種苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料采自云南昆明地區(qū)處于分蘗期的香根草植株。

1.2 試驗設(shè)計

在香根草各培養(yǎng)階段配制含不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度的培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑配比采用正交表L9（34）設(shè)計，即設(shè)置4個因素，每個因素設(shè)置3個水平［23-24］。本試驗中因素是指各培養(yǎng)階段的4種植物生長調(diào)節(jié)劑種類（4列），若植物生長調(diào)節(jié)劑只有3種，則把正交表L9（34）的第4列作為空列；水平是指各培養(yǎng)階段每種植物生長調(diào)節(jié)劑的3種濃度（3行），正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗L9（34）因素水平表 mg/L

根據(jù)正交設(shè)計表L9（34），每個培養(yǎng)階段各因素設(shè)置水平見表2所示，共設(shè)置9個處理。即在誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)各階段分別添加9種不同配比的植物生長調(diào)節(jié)劑于MS基本培養(yǎng)基中，配制成不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基備用，4個階段共計36種培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基附加食用白糖30 g/L，瓊脂7 g/L，并調(diào)節(jié)pH值為5.5～5.8。

表2 正交試驗L9（34）設(shè)計表

1.3 外植體的選擇和消毒

將香根草整株拔起，剪取基部分蘗節(jié)，用洗衣粉水清洗后，再用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上用含75%酒精的棉球迅速擦拭材料一遍后，再用刀片切取莖稈上部第1至第3個帶節(jié)莖段，每個莖段大小約3 cm，放入0.1%氯化汞溶液中消毒15 min，然后放入含2%次氯酸鈉和2滴吐溫-20的混合溶液中消毒15 min，消毒過程中不時振蕩材料，之后用無菌水沖洗3次，每次約2 min，即可獲得無菌材料。

1.4 試驗方法與數(shù)據(jù)處理

用鑷子把消毒后的莖段接種在添加9種植物生長調(diào)節(jié)劑配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶6個莖段。接種20 d后，每個處理隨機(jī)選取無污染和死亡的3瓶苗（3次重復(fù)），記錄其莖段不定芽的誘導(dǎo)率。將誘導(dǎo)出的芽在MS培養(yǎng)基中過渡培養(yǎng)30 d后，選取苗高1.5 cm以下，生長狀況相對一致的叢生芽，轉(zhuǎn)接到添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比的增殖培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基中，每瓶6個叢生芽，每個處理接種5瓶；將苗高超過1.5 cm的叢生芽切成單株，轉(zhuǎn)接到添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比的生根培養(yǎng)基中，每瓶15株。置于溫度為（23±2）℃、光照強(qiáng)度為40～50 μmol/（m2·s）的培養(yǎng)室中，光照時間為10 h/d。培養(yǎng)20 d后，每個處理隨機(jī)抽取無污染的3瓶苗（3次重復(fù)），觀察并記錄試驗結(jié)果。主要記錄的指標(biāo)包括：誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的不定芽的誘導(dǎo)率、增殖培養(yǎng)階段的繁殖系數(shù)、壯苗培養(yǎng)階段觀察有效苗生長情況以及生根培養(yǎng)階段的生根率，各指標(biāo)的計算方法為：

誘導(dǎo)培養(yǎng)階段不定芽的誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出不定芽的莖段數(shù)/接種時的莖段數(shù)）×100%；

增殖培養(yǎng)階段的繁殖系數(shù)=調(diào)查時的0.5 cm以上植株數(shù)量/繁殖接種時0.5 cm以上的植株數(shù)量；

壯苗培養(yǎng)階段的有效苗率（%）=調(diào)查時的1.5 cm以上植株數(shù)量/壯苗接種時的0.5 cm以上植株數(shù)量×100%；

生根培養(yǎng)階段的生根率（%）=生根株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel工作表和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并利用Duncan’ s新復(fù)極差法對各處理的差異顯著性進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理不同培養(yǎng)階段指標(biāo)測量值

培養(yǎng)20 d后，不同培養(yǎng)階段各處理的測量指標(biāo)值見表3。由表3可知，各培養(yǎng)階段處理間的差異顯著，各植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草組織培養(yǎng)的影響存在互作效應(yīng)。各處理誘導(dǎo)階段誘導(dǎo)率介于22.3%～77.7%，以處理9的誘導(dǎo)率最高；各處理增殖階段繁殖系數(shù)介于1.6～4.6，以處理6的繁殖系數(shù)最高；各處理壯苗階段有效苗率介于0～80.0%，處理9不利于有效苗的形成，而處理4則對有效苗形成最有利；各處理生根階段生根率介于37.7%～100%，其中處理4的香根草全部長出根系。綜上，除增殖階段繁殖系數(shù)外，各階段指標(biāo)值均以處理4的最高。

表3 各處理在不同培養(yǎng)階段的指標(biāo)測量值

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草誘導(dǎo)培養(yǎng)階段不定芽誘導(dǎo)率的影響

由每種因素水平的均值（Ki）大小可總結(jié)出每個培養(yǎng)階段各植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳水平組合，并由因素內(nèi)水平極差（R）的大小可以反映出每個培養(yǎng)階段各種植物種質(zhì)調(diào)節(jié)劑對香根草生長的影響大小［25-26］。

由表4可知，因素內(nèi)水平極差大小反映了3種因素對香根草誘導(dǎo)培養(yǎng)階段不定芽誘導(dǎo)率的影響程度，即參試的3種植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草不定芽誘導(dǎo)的影響的主次關(guān)系是2,4-D＞6-BA＞NAA。由各因素水平的均值大小可得到植物生長調(diào)節(jié)劑的最優(yōu)水平組合為A3B3D2，對照表1的正交試驗L9（34）因素水平，即得到香根草誘導(dǎo)培養(yǎng)階段植物生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)配方為6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L，最優(yōu)配方不定芽的誘導(dǎo)率最高，即處理9的誘導(dǎo)率最高，這與表3的試驗結(jié)果吻合，且與表2中誘導(dǎo)培養(yǎng)階段處理9的植物生長調(diào)節(jié)劑配方一致。研究表明，在試驗水平內(nèi)6-BA和NAA濃度越高對香根草不定芽的誘導(dǎo)越好，2,4-D在濃度介于0～0.5 mg/L時對不定芽誘導(dǎo)影響較大，以濃度0.1 mg/L時促進(jìn)效果最好。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草誘導(dǎo)培養(yǎng)階段不定芽誘導(dǎo)率的影響 %

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對增殖培養(yǎng)階段繁殖系數(shù)的影響

由表5可知，因素內(nèi)水平極差大小可以反映出4種植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草增殖培養(yǎng)的影響程度，其對香根草叢生芽繁殖系數(shù)影響的主次關(guān)系為IAA＞KT＞6-BA＞NAA。IAA對香根草的繁殖影響最大，但為負(fù)效應(yīng)，因此，在增殖階段不宜添加IAA。由因素水平的均值大小可看出，在0～0.5 mg/L KT范圍內(nèi)，添加0.2或0.5 mg/L KT時香根草增殖培養(yǎng)階段繁殖系數(shù)均為3.7，即此2種濃度KT的增殖效果一樣。因此，篩選出有利于香根草叢生芽快速繁殖的植物生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)組合為A1B2C1E2，對照表1的正交試驗L9(34)因素水平，即得出植物增殖培養(yǎng)生長調(diào)節(jié)劑的最佳配方為6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草增殖培養(yǎng)階段繁殖系數(shù)的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對壯苗階段有效苗率的影響

由表6可知，因素內(nèi)水平極差大小可以反映出3種植物生長調(diào)節(jié)劑對壯苗階段有效苗率影響的主次關(guān)系是NAA＞6-BA＞IAA。有利于香根草壯苗生長的植物生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)組合為A2B1C2，對照表1的正交試驗L9(34)因素水平，即得香根草壯苗培養(yǎng)階段植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳配方為6-BA 0.3 mg/L+IAA 0.2 mg/L，即處理4的有效苗率最高，該結(jié)果與表3的試驗結(jié)果相吻合。NAA雖然對香根草苗高的影響最大，但為負(fù)效應(yīng)，因此，壯苗培養(yǎng)階段不宜添加NAA。

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草壯苗階段有效苗率的影響 %

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對生根階段生根率的影響

由表7可知，因素內(nèi)水平極差大小可以反映出3種植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草生根階段生根率影響的主次關(guān)系為IAA＞NAA＞IBA。同樣，由各因素水平(Ki)的均值大小分析出有利于香根草生根的最優(yōu)植物生長調(diào)節(jié)劑組合為B1C1F1，對照表1的正交試驗L9(34)因素水平，可知NAA濃度 0.1 mg/L為植物生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)配方。NAA和IAA濃度在試驗水平內(nèi)，濃度越高越不利于香根草生根，IAA雖然對香根草生根影響最大，但為負(fù)效應(yīng)，因此生根階段不宜添加IAA。

表7 植物生長調(diào)節(jié)劑對香根草生根階段生根率的影響 %

3 討論與結(jié)論

植物生長調(diào)節(jié)劑在香根草組培生長中的應(yīng)用研究已有相關(guān)報道，但由于試驗設(shè)計選取的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同，導(dǎo)致香根草各培養(yǎng)階段的最適植物生長調(diào)節(jié)劑配方存在較大差異。王棟等［18］認(rèn)為各階段選取的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)培養(yǎng)配方：誘導(dǎo)階段為6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖階段為2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L，生根階段為IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+0.5 mg/L；楊冰冰等［19］認(rèn)為各階段選取的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)培養(yǎng)配方：誘導(dǎo)階段為2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，增殖階段為6-BA 1.0 mg/L，生根階段為IBA 0.1 mg/L+PP333 0.1 mg/L。殷麗青等［20］認(rèn)為各階段選取的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)培養(yǎng)配方：誘導(dǎo)階段為BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖階段為BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根階段為IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L。韓露等［21］認(rèn)為各階段選取的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)培養(yǎng)配方：誘導(dǎo)階段為6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L，增殖階段為6-BA 3.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L，生根階段為6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L。姚振等［22］認(rèn)為各階段的選取生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)培養(yǎng)配方：誘導(dǎo)階段為2,4-D 0.5 mg/L，增殖階段為6-BA 2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L，生根階段為IAA 0.2 mg/L。綜上，前人的研究結(jié)果對香根草種苗生產(chǎn)中植物生長劑種類的選擇上有一定的指導(dǎo)作用。基于此，本研究應(yīng)用正交設(shè)計方法，在前人研究的基礎(chǔ)上用有限的試驗處理優(yōu)化了香根草各組培生長階段植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳配方，并明確了香根草各培養(yǎng)階段植物生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生長的作用大小。

本試驗結(jié)果表明，植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D對香根草的不定芽誘導(dǎo)影響較大、IAA對增殖和生根影響較大、NAA對壯苗影響較大。在香根草種苗生產(chǎn)前期要控制好2,4-D的使用量，在生產(chǎn)后期生根階段最好不使用IAA，并控制好NAA的使用量，IBA對香根草生根雖然影響不大，但使用后反而不利于生根。NAA不利于種苗增高，當(dāng)苗較矮時，不宜使用NAA，建議配合使用適宜濃度的6-BA和IAA進(jìn)行增高壯苗，當(dāng)苗高超過1.5 cm后，可單獨使用濃度為0.1 mg/L的NAA誘導(dǎo)根系的發(fā)生。在本研究中，誘導(dǎo)和壯苗階段的直觀分析結(jié)果和試驗結(jié)果一致，但在增殖和生根階段出現(xiàn)直觀分析結(jié)果和試驗結(jié)果不一致的情況，說明即使在植物生長調(diào)節(jié)劑濃度梯度范圍內(nèi)，通過有限的試驗處理也較難獲得合理的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比。本研究采用的正交設(shè)計方法具有試驗均衡分散、數(shù)據(jù)計算簡單、水平整齊可比等優(yōu)點，通過使用正交試驗法減少了測試用例，采用有限的試驗處理就能有效地比較試驗結(jié)果并找出最優(yōu)的試驗條件。

本研究在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段可同時誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽，繼代轉(zhuǎn)接時，叢生狀比單株接種方式好，苗的繁殖力及長勢強(qiáng)，在生根培養(yǎng)時叢生芽和單株的生根率無明顯差別。本試驗的目標(biāo)是力求研究結(jié)果服務(wù)于香根草種苗生產(chǎn)者，為市場快速提供優(yōu)質(zhì)種苗，因此，試驗設(shè)計方法和試驗統(tǒng)計方法需具有較強(qiáng)實用性和可操作性。為此，本試驗設(shè)計方案中生根培養(yǎng)轉(zhuǎn)接單株材料，繁殖與壯苗培養(yǎng)均轉(zhuǎn)接塊狀叢生芽材料。在培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)有的處理會產(chǎn)生原球莖和畸形芽，因此，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，只統(tǒng)計不定芽的誘導(dǎo)率，而不是愈傷組織的誘導(dǎo)率。增殖和壯苗培養(yǎng)階段數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，接種前均只記錄了苗高0.5 cm 以上的植株數(shù)量，接種后的增殖培養(yǎng)階段只記錄了苗高0.5 cm 以上的植株數(shù)量，壯苗培養(yǎng)階段只記錄了苗高1.5 cm 以上的植株數(shù)量。本試驗是在前人研究及預(yù)試驗基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計探究香根草各培養(yǎng)階段植物各種生長調(diào)節(jié)劑對組培苗生長影響的主次關(guān)系，并根據(jù)有限的試驗處理結(jié)果進(jìn)一步分析出各培養(yǎng)階段適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑配方。因此，本試驗結(jié)果對香根草優(yōu)質(zhì)種苗標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)作用和應(yīng)用價值。