畢節地區6個綿羊品種FecB基因微衛星座位多態性研究

宋德榮， 吳瑛， 林如濤， 單春蘭， 馬金萍，孫忠鑫， 熊艷玲， 劉勇慶， 胡飛飛

1. 畢節市畜牧獸醫科學研究所，貴州 畢節 551700；2. 貴州大學 動物科學學院，貴陽 550025

貴州省位于我國西南地區, 省內綿羊養殖歷史悠久[1], 其中綿羊主產區有畢節市威寧縣、 納雍縣等． 貴州省養殖的綿羊主要為地方品種威寧綿羊、 小尾寒羊、 湖羊等． 雖品種較多, 有適應性能優良、 抗逆性強等特點, 但大多數地方品種生長速度慢、 繁殖能力低, 已然成為制約地方綿羊養殖產業發展的重要因素． 因此, 對省內地方品種進行改良, 培育更加優良的新品系, 加快發展肉羊產業, 對促進現代畜牧業技術進步、 提高農民收入和改善居民肉類消費結構具有重要意義．

微衛星DNA是一類廣泛分布于真核及原核生物基因組中的短串聯重復序列(1～5 bp), 又稱為簡單重復序列(Short tandem repeats, STRs)或短串聯重復序列(Simple sequence repeat, SSR), 約占真核基因組的5%, 多存在于基因編碼區附近, 也存在于基因組中的間隔區及基因內的外顯子、 內含子和調控區域． 由于重復單位的重復數量在個體間呈高度變異性且變異數量豐富, 因此微衛星座位的應用非常廣泛, 已經發展成為畜牧業經濟動物育種領域中常用的分子標記之一[2]． 王婷等[3]在四川省涼山地區6個綿羊群體的遺傳多樣性研究中, 利用12個微衛星座位計算綿羊群體的基因頻率、 有效等位基因數、 雜合度及多態信息含量, 評估了群體內遺傳多樣度, 進而通過遺傳距離聚類圖、 群體結構推測圖、 主成分分析及群體間分子方差分析等評估群體間遺傳關系． 周建設[4]利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術, 對豬BMP7外顯子及內含子區域的6個微衛星座位多態性進行檢測, 并對它們的遺傳變異特性及與豬繁殖性狀的相關性進行了分析, 發現STC,STA與豬繁殖性狀密切相關． 這些研究為開展貴州省畢節市羊群體微衛星座位遺傳多樣性與繁殖性的相關分析提供了參考．

羊FecB(Fecundity Booroola,FecB)基因于1989年被命名, 最明顯的生理效應是增加卵巢中的卵泡數量和排卵數量． 前人研究發現, 一個拷貝的FecB基因可增加母羊排卵數1.65個[5]． 在表型上, 該基因純合的Booroola母羊(BB型)平均排卵數能達到4.65個, 極顯著高于對照組[2]． 鑒于FecB基因的主要遺傳效應是增加排卵數, 因此國內外學者廣泛關注FecB基因研究． Davis等[6]在中國湖羊和小尾寒羊兩個品種羊基因組中發現FecB基因突變． 我國學者已對很多地方綿羊品種進行了FecB檢測, 發現湖羊、 小尾寒羊、 多浪羊和中國美利奴羊也存在FecB基因[7], 同時至少發現9個品種存在FecB突變[8-9]．

關于FecB基因突變與羔羊出生質量之間的關系已有部分研究． 然而關于FecB微衛星座位及與貴州省畢節市羊群實際產子數的關聯分析尚不清楚． 因此, 本試驗通過檢測畢節地區6個綿羊品種FecB基因6個微衛星座位的多態性, 分析它們在6種羊品種中的多態分布情況, 并探討微衛星座位與羊產羔性能的關系, 以期為FecB基因在貴州省畢節市羊品種的分子標記輔助育種中提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

湖羊與威寧綿羊雜交品系(HW)55頭、 威寧綿羊(W)30頭、 湖羊(HY)30頭、 薩福克羊與威寧綿羊雜交品系(SW)20頭、 薩福克羊(SFK)30頭、 薩福克羊與半細毛羊雜交品系(SB)20頭的血液及耳組織樣品采自貴州省畢節市威寧縣、 赫章縣, 并記錄其年產羔羊數; 每只羊無菌采集血液和耳組織樣品后低溫保存帶回實驗室, -20 ℃保存備用．

1.1.2 引物設計與合成

根據GenBank中的FecB序列, 選擇位于綿羊2號染色體FecB區域可能與繁殖性能相關性較大的6個微衛星座位(LSCV043,GC101,471U,Bulge5,BMS2508,300U), 引物由上海生工生物工程技術服務公司合成(表1)．

表1 微衛星引物名稱及序列

1.2 方法

1.2.1 基因組的提取

耳組織50 mg或者靜脈血200 μL用于抽提DNA, 提取方法參照天根血液/組織/細胞DNA提取試劑盒說明書進行． 提取樣品DNA后, TE(Tris和EDTA配置而成)溶解, 用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的純度和體積質量分數, 隨后-20 ℃保存備用．

1.2.2 PCR反應體系

PCR反應體系為20 μL, 包含Tiangen PCR mix 2×buffer 10 μL, 兩側引物各0.5 μL, DNA模板1 μL, 用ddH2O補足20 μL． PCR反應程序為: 94 ℃預變性5 min, 94 ℃變形30 s, 退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共計30個循環; 再延伸72 ℃ 5 min; 4 ℃保存備用．

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

擴增產物用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 電泳條件: 在恒壓220 V, 1.0×TBE緩沖液中電泳7～10 h, 硝酸銀染色法顯色后, 用凝膠成像系統拍照并保存．

1.2.4 微衛星檢測方法

將染色后的凝膠用凝膠成像系統復制保存, 并利用Kadak Digitial Science ID Image分析軟件根據標準PBR322/MspI Maker計算片段大小．

1.3 統計分析

等位基因頻率(Allele frequencies): 微衛星座位呈等顯性遺傳狀態, 其等位基因頻率根據電泳圖譜統計后獲得; 利用Cervus 3.0 軟件(Cervus公司)統計6個群體不同位點的等位基因數、 期望雜合度、 觀測雜合度和多態信息含量． 利用SPSS 22.0軟件的線性回歸對不同微衛星座位與繁殖性狀進行關聯分析, 初步確定與繁殖性狀存在顯著差異的位點,p<0.05為差異具有統計學意義．

2 結果與分析

2.1 6個羊品種微衛星多態位點的等位基因及頻率分析

6對微衛星座位引物均能在6個羊群組中穩定擴增． 微衛星座位的等位基因片段數量及大小如表2所示, 其中微衛星座位LSCV043共檢測到4個等位基因, 片段大小為114～160 bp; 微衛星座位BMS2508共檢測到6個等位基因, 片段大小為150～190 bp; 微衛星座位300U共檢測到5個等位基因, 片段大小為148～178 bp; 微衛星座位GC101共檢測到4個等位基因, 片段大小為196～238 bp; 微衛星座位Bulge5共檢測到4個等位基因, 片段大小為136～160 bp; 微衛星座位471U共檢測到3個等位基因, 片段大小為196～204 bp．

表2 不同微衛星座位的等位基因

表3列出了每個微衛星座位在6個群體中的等位基因頻率． 所謂優勢等位基因, 就是指某特定品種在特定的基因座位上相對集中的等位基因, 優勢等位基因集中可能說明該位點為大多數綿羊所共有, 有可能是起源進化最早、 最原始的基因． 從表3中可以看出, 每個位點都占有一定優勢的等位基因．

表3 6個微衛星座位在6個綿羊群體中的等位基因頻率

各個微衛星座位等位基因頻率在不同綿羊群體中具有明顯差異, 對6個綿羊群體6個微衛星座位基因頻率的統計結果見表3． 結果顯示, 在微衛星座位LSCV043中, 等位基因114 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(10.00%～70.00%), 160 bp出現的頻率最低, 且僅在薩福克羊及薩福克與半細毛羊雜交品系中出現; 在微衛星座位BMS2508中, 等位基因162 bp在6個綿羊群體中出現的頻率最高(16.67%～60%), 156 bp出現的頻率最低, 且未能在湖羊與威寧綿羊雜交品系、 薩福克與威寧綿羊雜交品系及薩福克羊中檢測到; 在微衛星座位300U中, 等位基因160 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(41.67%～50.00%), 168 bp出現的頻率最低, 且僅在薩福克羊與威寧綿羊雜交品系中檢測到; 在微衛星座位GC101中, 等位基因200 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(10.00%～50.00%), 238 bp出現的頻率最低, 且未能在威寧綿羊品系中檢測到; 在微衛星座位Bulge5中, 等位基因136 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(55.00%～63.33%), 146 bp出現的頻率最低, 且未能在薩福克羊品系中檢測到; 在微衛星座位471U中, 等位基因200 bp在6個綿羊群體中的頻率最高(60.00%～90.00%), 196 bp出現的頻率最低, 且未能在威寧綿羊和湖羊品系中檢測到．

2.2 6個羊群組微衛星預期雜合度值(He)、 有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)

6個微衛星座位的遺傳指標見表4、 表5、 表6． 微衛星座位在群體內多態性信息含量有一定的差異, 各群體有效等位基因數(Ne)的范圍在1.7～4.01之間, 其中湖羊與威寧綿羊雜交品系在微衛星座位BMS2508有最高的有效等位基因數量(4.017 9); 薩福克羊在微衛星座位471U有最低的有效等位基因數量(1.219 5), 表明貴州省畢節市綿羊群體存在等位基因差異, 但差異并不明顯．

表4 6個微衛星座位在6個羊群體中的有效等位基因數(Ne)

表5 6個微衛星座位在6個羊群體中的香農指數

表6 6個微衛星座位在6個羊群體中的預期雜合度值(He)

6個微衛星位點的香農指數如表5所示, 其數值越大表明群體間多樣性越高． 微衛星座位BMS2508在湖羊品系中最高(1.608 9),LSCV043座位在湖羊與威寧綿羊雜交品系中多態性更好(1.074 0),300U座位在薩福克羊與威寧綿羊雜交品系中最高(1.424 1),GC101座位在薩福克羊與半細毛羊雜交品系中最高(1.329 7)．Bulge5座位在湖羊品系中最高(1.165 5),471U座位在薩福克羊與半細毛羊雜交品系中最高(0.848 7), 該結果進一步提示各羊群品系在6個微衛星座位間存在多態性差異．

6個微衛星座位的預期雜合度值(He)如表6所示,LSCV043座位在湖羊與威寧綿羊雜交品系中期最高(0.651 1), 在薩福克羊品系中最低(0.48);BMS2508座位在湖羊品系中最高(0.77), 在薩福克羊品系中最低(0.48);300U座位在薩福克和威寧綿羊雜交品系中最高(0.722 2), 在薩福克羊品系中最低(0.62);GC101座位在薩福克與半細毛羊雜交品系中最高(0.722 2), 在薩福克羊與威寧綿羊雜交品系中最低(0.611 1);Bulge5座位在湖羊品系中最高(0.625), 在薩福克羊品系中最低(0.48);471U座位在薩福克羊與半細毛羊品系中最高(0.493 8), 在薩福克羊品系中最低(0.18)． 表6結果提示貴州地方品種及雜交后代遺傳多態性較高, 而薩福克羊的遺傳多態性較低, 基因保守型較好．

用多態信息含量(PIC)可以描述微衛星座位的變異程度． 當PIC>0.5時為高度多態基因座位; 0.250.5);BMS2508座位在除薩福克品系的其他品系中, 均屬于高度多態水平(PIC>0.5);LSCV043座位在各組羊群中均屬于中度多態基因座位(0.250.5);471U座位在各組羊群中均為中度和低度多態基因座位．

表7 6個微衛星座位在6個羊群體中的多態信息含量(PIC)

2.3 6個羊群遺傳距離分析

遺傳距離是指兩個群體間的遺傳差異(基因組差異), 但也常用等位基因頻率的函數來度量遺傳差異． 從表8中可知, 湖羊和威寧綿羊雜交品系與湖羊、 威寧綿羊遺傳距離較近, 分別為0.908 8和0.923 5; 薩福克羊、 半細毛羊與湖羊、 湖羊和威寧綿羊雜交品系及威寧綿羊等遺傳距離較遠．

表8 6個種群標準遺傳距離結果(Nei)

2.4 微衛星座位300U,GC101的不同基因型與湖羊和威寧綿羊雜交品系(HW)產羔羊數的關系

微衛星座位300U各基因型與湖羊和威寧綿羊雜交品系(HW)產羔羊數的最小二乘平均值±標準誤見表9． 從表9中可以看出, 基因型148/160 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.81只, 且與其他基因型差異顯著(p<0.05), 其次是160/164 bp, 也達到了1.53只, 而基因型160/168 bp對應的最小二乘平均值最低, 為1.17只(p<0.05)． 從表10中可以看出, 微衛生座位GC101基因型200/238 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.74只, 顯著高于196/196 bp、 210/238 bp和200/210 bp(p<0.05), 其次是196/210 bp, 也達到了1.55只, 而基因型200/210 bp對應的最小二乘平均值最低, 為1.27只(p<0.05)．

表9 HW微衛星座位300U各基因型與產羔羊數的最小二乘平均值

3 討論

微衛星DNA廣泛分布于真核生物基因組中, 具有隨機性、 呈共顯性遺傳、 遵循孟德爾遺傳規律的特點． 同一個體不同年齡段、 不同組織器官、 皮膚、 毛發等產生的DNA指紋圖完全一致, 微衛星等位基因的差異主要來自核心區重復單位數目的變化[10]． 本研究涉及的貴州省畢節市6個品種綿羊共檢測到13個微衛星等位基因和40種基因型, 其中BMS2508座位、LSCV043座位、Bulge5座位均為中度或高度多態位點, 而471U座位在各組羊群中均為中度和低度多態基因座位, 提示BMS2508座位、LSCV043座位、Bulge5座位可作為篩選羊群基因型的潛在分子標記． 群體多態信息含量(PIC)和預期雜合度值(He)都能反映群體內個體遺傳變異的程度, 數值高說明遺傳變異大, 反之則群體內的遺傳變異小． 在本研究的 6個綿羊群體中湖羊與威寧綿羊、 薩福克與半細毛羊雜交品系的多態信息含量(PIC)、 預期雜合度值(He)較高, 而湖羊、 威寧綿羊、 薩福克羊品系相對較低, 說明貴州省畢節市雜交羊群較本地純種威寧綿羊的遺傳變異大． 近年來, 不斷有研究者通過雜交選育手段將FecB基因導入繁殖能力較低的羊群中, 以提高經濟效益． 王偉霞等[11]以不含有FecB基因的美利奴羊為父本, 以小尾寒羊公羊與東北細毛羊母羊雜交品系為母本進行雜交, 結果發現FecB基因對提升后代的產羔性能發揮重要作用． 張也等[12]以白頭杜泊羊為父本, 以湖羊為母本進行雜交, 結果表明FecB基因對杜湖雜交品系后代母羊的產羔率有影響． 綜上所述,FecB基因總體上對綿羊繁殖性能產生良性影響．

FecB基因是綿羊高繁殖力的一個主效基因, 1993年Montgomery等[13]首先報道FecB基因與微衛星基因座位OarAE101和OarHH55緊密連鎖, 遺傳距離分別為13 cM和20 cM． 等位基因數是群體遺傳多樣性分析的重要參數之一, 其數量與樣本含量和研究涉及的座位數有關． 在基因座位數相同的條件下, 樣本量越大, 可檢測到的等位基因數越多． 張林等[14]報道,LSCV043微衛星座位98 bp等位基因與小尾寒羊FecB基因B等位基因之間存在一定的連鎖不平衡關系, 證明其是與小尾寒羊多羔主效基因緊密連鎖的一個遺傳標記． 吳舒潔等[15]報道, 小尾寒羊FecB基因B等位基因與471U微衛星座位 200 bp等位基因之間存在一定的連鎖不平衡關系． 本研究開展了貴州省畢節市FecB基因微衛星座位多態性和繁殖性狀統計, 并就二者的相關性進行了分析． 研究發現, 微衛星座位300U在湖羊與威寧綿羊雜交品系中等位基因數為5個, 其中基因型148/160 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.81只; 微衛星座位GC101基因型200/238 bp對應的最小二乘平均值最高, 達到了1.74只, 可用于初步輔助選擇, 但這部分基因型個體在群體中的比例并不高, 同時產羔羊數在一定程度上還受到環境、 營養狀況和飼養管理水平的影響． 因此, 微衛星座位300U和GC101作為湖羊與威寧綿羊雜交品系繁殖力的分子標記, 尚需要擴大樣本進一步研究．

4 結論

本研究檢測了6種綿羊群體中FecB基因上6個微衛星座位的多態性,300U和GC101可作為篩選羊群繁殖性狀的分子標記, 其中微衛星座位300U基因型148/160 bp, 微衛星座位GC101基因型200/238 bp與湖羊和威寧綿羊雜交品系產羔羊數的關聯性最強, 提示其可作為篩選羊群繁殖力的分子標記．