蘋果維生素C 含量幾種測定方法比較

確山縣農業綜合行政執法大隊 連敏 王勇

維生素C 普遍存在于植物體內，在植物的多個生理代謝活動中發揮著非常重要的作用。在對植物的研究中發現，植物體內維生素C 含量越高，其抗逆性越強。同時，維生素C 具有抗氧化、防止衰老等功效。但是，人類本身缺少維生素C，人體內生物合成代謝途徑中的一種關鍵酶無法合成人體所需的維生素C，因此，人們身體所需的維生素C 只能從新鮮的水果或蔬菜中獲取。蘋果富含維生素C、果膠、有機酸、膳食纖維和礦物質等營養物質，是老少皆宜的大眾水果。鑒于蘋果產業的健康發展及維生素C 對動植物必不可少的作用，篩選蘋果中維生素C 含量測定方法就顯得尤為重要。

維生素C 具有氧化性和還原性，在蘋果果實中維生素C 具有很強的還原性，蘋果切開后，維生素C 在空氣中很不穩定，容易氧化。維生素C 的檢測方法有很多，如滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等，本文對這幾種常用的檢測方法進行比較分析，篩選出一種適合蘋果維生素C 含量測定的方法。

一、維生素C 測定方法

（一）滴定法測定維生素C

滴定法測定蘋果中維生素C 所用藥品和儀器均較少，操作過程需要對每個蘋果樣品進行過濾后滴定，比較費時，維生素C 在空氣中暴露時間久了容易被氧化，測定的結果易偏低。該方法可以對蘋果中維生素C 中含量進行簡單的相對比較，不能準確測定蘋果中維生素C的含量。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，再將樣品融入2%的草酸中，充分混勻避光放置30 min 后過濾，濾液便可進行滴定。樣品設置3 次重復。由于維生素C 具有還原性，藍色染料2,6-二氯酚靛酚具有氧化性，并且該染料在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍色。滴定過程中當樣品溶液中維生素C 被完全氧化后該染料在草酸溶液中便會呈現出紅色。根據滴定草酸樣品所用的藍色染料2,6-二氯酚靛酚溶液的量，再利用公式便可計算出蘋果果肉中維生素C 的含量。

（二）熒光分光光度法測定維生素C

熒光分光光度法測定蘋果果肉中維生素C 所用藥品和儀器少，但操作步驟較多，測定的準確度比滴定法測定稍微高些。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，然后在樣品中加入偏磷酸-冰醋酸溶液，充分混勻后加入適量活性炭，劇烈震蕩20 min 后過濾，取一定量濾液加入定量的硼酸-醋酸鈉，充分搖勻后放置10 min，稀釋到定量濃度便可作為樣品溶液。按照步驟制定維生素C 的標準曲線溶液。在樣品溶液和標準曲線溶液中分別加入定量的鄰苯二胺，混合后避光反應35 min 后邊便可進行測定。樣品設置3 次重復。維生素C 與活性炭反應，可被氧化成脫氧抗壞血酸，它與鄰苯二胺進行反應生成喹喔啉，利用分光光度計在激發波長351 nm 和發射波長432 nm 處測定喹喔啉的熒光強度。根據公式便可計算出蘋果果肉中維生素C 的含量。

（三）紫外分光光度法測定維生素C

紫外分光光度法測定蘋果果肉中維生素C 時，前面對樣品抽提較麻煩，整個操作過程所用藥品偏多，該方法測定維生素C 時所用到的低溫離心機和進口酶標儀價格較高。因為前面操作步驟比較煩瑣，維生素C 容易被氧化，所以測定蘋果果肉中維生素C 含量不是很準確。紫外分光光度法適合大批量測定樣品，酶標儀檢測靈敏度高、速度快，1 次2 min 便可檢測96 個樣品。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預冷的HCL 溶液進行充分抽提，抽提時間為30 min，且中間需要顛倒混勻5 次。樣品設置3 次重復。然后利用低溫離心機進行離心，取一定量的上清液加入NaH2PO4，并用NaOH 調試溶液的pH。混勻后取上清液加入一定濃度的NaH2PO4和二硫蘇糖醇，在25℃ 條件下黑暗反應30 min。蘋果內維生素C 分為氧化型和還原型，二硫蘇糖醇具有強還原性，能將蘋果內氧化型維生素C 還原為還原型維生素C，在波長265 nm 處便可測定。取一定量前面抽提的上清液加入NaH2PO4，用酶標儀測定吸收波長為265 nm 處的值，最后加 AO 酶，反應后再測1 次數值。樣品設置3 次重復。根據維生素C 標準曲線便可測定出蘋果果肉中維生素C的含量。

（四）高效液相色譜法測定維生素C

高效液相色譜法測定蘋果果肉中維生素C 時，整個操作步驟相對簡單、檢測速度也快，測定結果也較準確，但高效液相色譜法所用高效液相色譜儀價格非常高。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預冷的HPO3溶液進行充分抽提，抽提時間30 min，且中間需要顛倒混勻5 次。樣品設置3 次重復。采用低溫離心機離心，并用微孔濾膜抽濾上清液進行備用。然后再濾液中加入一定量的二硫蘇糖醇，25℃黑暗條件下反應約15 min。蘋果果肉經HPO3溶液抽提后，維生素C 便可用微孔濾膜分離出來。此時便可用高效液相色譜儀在254 nm 處檢測其峰值。用高效液相色譜儀在波長為254 nm 測出樣品溶液中總維生素C 含量，流動液相為乙酸緩沖液，測定時流速為1.0 mL·min-1，根據維生素C 標準曲線和出峰的峰面積 即可測定出蘋果果肉中維生素C 的含量。

二、結論與討論

由于維生素C 具有還原性，在空氣中不穩定，極易被氧化，所以前人對維生素C 含量的測定方法做了很多研究。本文通過對滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法4 種測定方法進行比較，發現高效液相色譜法具有操作簡便、靈敏度更高、準確度高等優點，更適合測定蘋果中維生素C 含量。

高效液相色譜法雖然比較適合測定蘋果中維生素C含量，但是該方法所用到的高效液相色譜儀價格昂貴，且高效液相色譜儀開機比較麻煩，適合大批量測定樣品，測定樣品時費用較高。其他幾種方法雖然準確性有點低，但可以對蘋果中維生素C 中含量進行簡單的比較。