葡萄CHS基因家族鑒定與表達分析

成永娟 張明月 曹雪璟 毛娟 陳佰鴻

摘要：【目的】明確葡萄查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因家族響應外源激素和非生物脅迫的表達模式。【方法】利用生物信息學方法對葡萄CHS基因家族成員進行理化性質、系統進化、共線性、順式作用元件等分析。采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測VvCHS基因在外源激素和非生物脅迫下的表達情況，將篩選出的VvCHS3 基因構建植物表達載體并進行煙草瞬時轉化以確定其表達位置。【結果】在葡萄基因組中共鑒定出7個VvCHS基因成員，分布于5 條不同的染色體上，蛋白質二級結構以α-螺旋和不規則卷曲為主。系統進化和基因對選擇壓表明，CHS基因家族基因可分為三大亞族，葡萄CHS基因家族與其他物種之間主要進行純化選擇。共線性分析表明，VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4 與VvCHS5 之間存在共線性關系。順式作用元件預測結果表明，大部分VvCHS基因成員可能同時對多種逆境脅迫有響應。qRT-PCR分析發現，VvCHS基因具有明顯的組織特異性，在根中表達水平最高，莖中表達水平最低。在5 mmol·L-1水楊酸（salicylic acid，SA）處理下，VvCHS3 基因在莖中的表達水平顯著高于對照，為對照的44.3 倍，在0.1 mmol·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理下，VvCHS3 基因在葉中顯著上調表達，為對照的36.1 倍。在400 mmol·L-1 NaCl 處理下，VvCHS5 基因在根中相對表達量高于對照，為對照的30.6 倍。在4 ℃和10%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理下，VvCHS4 基因在根中顯著上調表達。成功克隆得到VvCHS3 基因，經農桿菌介導瞬時轉化煙草下表皮細胞，熒光倒置顯微鏡檢測表明VvCHS3 基因定位于細胞核和細胞膜，與預測結果相符。【結論】葡萄CHS基因家族參與SA和MeJA等外源激素的調控，同時響應低溫、干旱和高鹽脅迫。

關鍵詞：葡萄；查爾酮合酶；生物信息學；qRT-PCR；基因克隆

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0861-14

查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）屬于植物聚酮合酶超家族成員（polyketide synthase，PKS），PKS 可催化聚酮類化合物形成芪類化合物、黃酮類化合物、抗生素及真菌毒素等多種物質[1]。根據蛋白的結構可將PKS 分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，PKS- Ⅰ 、PKS- Ⅱ 型僅存在于微生物界，而PKS-Ⅲ型（CHS 超家族）則是由40～45 ku 的二聚體多肽形成，主要分布在植物界。Cys164、His303 和Asn336 是PKSs 家族高度保守的殘基，可催化生成一系列結構各異、生理活性不同的植物次生代謝產物[2]。Thr132、Ser133、Thr194、Thr197、Gly256、Phe265 和Ser338 是在CHS 中高度保守的殘基，但在其他Ⅲ型PKSs 中被相應的氨基酸替代，從而形成不同的產物[3]。

CHS是植物類黃酮合成途徑的第一個限速酶，可以催化底物4-香豆酰輔酶A（coenzyme A，CoA）與丙酚CoA 生成4，5，7-三羥基黃烷酮，產生各種黃酮類化合物，也可以在查爾酮異構酶（chalconeisomerase，CHI）的催化下，進一步衍生轉化成各類黃酮化合物[4]。花青苷合成途徑是類黃酮合成的一部分，花青苷物質在植物的花、葉、果皮等組織的著色過程中起著重要作用，而CHS基因參與花青苷合成的第一步縮合反應。同時，CHS基因也參與植物對非生物脅迫的響應，對植物花色形成、生長發育、逆境脅迫、激素調節和運輸都會產生影響[5]。此外，CHS 基因的表達受多種外源激素和非生物脅迫的誘導，例如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、干旱聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和低溫（4 ℃）等[6-8]。研究發現，EaCHS1 基因超表達提高了紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）對高鹽的耐受性[9]，桑葚（Fructus mori）CHS 基因能夠調控其耐鹽及耐旱性[10]，鈍鱗紫背苔（Plagiochasma Appendiculatum）PaCHS 基因顯著受SA 誘導[11]。CHS 超基因家族不同成員之間結構的微小差異，導致其表達模式略有不同。

到目前為止，CHS 基因在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、蘋果（Malus domestica）等物種中得到鑒定[12-15]，在甜橙（Citrus sinensis）等部分物種中進行了克隆和轉化研究[16]。CHS基因cDNA全長在1000 bp左右，編碼區高度保守，一般由2 個外顯子和1 個內含子構成；但是也有例外，如苔蘚（Physcomitrellapatens）PpCHS基因家族部分成員不含或含有2 個內含子[17]，虎杖（Polygonum cuspidatum）CHS基因含有3 個內含子[18]。

目前，葡萄CHS 基因家族雖有報道，但其在葡萄中響應外源激素和非生物脅迫的機制研究甚少。

因此，筆者在本研究中利用葡萄和擬南芥等植物基因組數據庫，利用生物信息學的方法篩選和鑒定葡萄CHS基因家族成員，并對葡萄CHS基因家族各成員的理化性質、亞細胞定位、基因結構和系統進化等進行分析，初步揭示了在不同外源激素和非生物脅迫下該家族基因在葡萄不同組織中的表達模式，同時進行了VvCHS3 基因的亞細胞定位實驗，為進一步揭示葡萄CHS 基因家族的功能與提高葡萄的抗逆性奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

本試驗于2020—2021 年在甘肅農業大學園藝學院進行。以黑比諾葡萄（Vitis vinifera L.‘PinotNoir）試管苗為試驗材料，將帶葉的單芽莖段轉接于裝有50 mL GS液體培養基的三角瓶中，以搭建紙橋的方法對材料進行固定培養，每瓶接種3 株，置于RDN型人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司，中國）中培養，培養條件為25 ℃，220 μmol·m-2 ·s-1光照16 h，22 ℃暗培養8 h，濕度為60%。繼代培養30 d 后，挑選生長健壯、無污染的試管苗，將其轉移至分別含有0.2 mmol · L-1 ABA、50 mg · L-1 赤霉素（gibberellin，GA3）、0.05 mg ·mL-1 萘乙酸（1-naphthlcetic acid，NAA）、5 mmol · L- 1 SA、0.1 mmol · L- 1 MeJA、400 mmol · L- 1 NaCl、10% PEG 的GS 液體培養基中。4 ℃處理在低溫植物培養箱（PERCIVAL LT-36公司，美國）中進行，處理時長均為24 h，以正常生長的試管苗作為對照（CK），每個處理5 瓶，3 次重復。

1.2 葡萄CHS基因家族的序列獲得和比對

從擬南芥基因組網站TAIR（https：//www.Arabidopsis.org/）下載CHS 基因的編碼序列（coding sequence，CDS），導入葡萄基因組數據庫（https：//www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/entry_ggb.html）進行BLAST搜索，下載葡萄CHS基因全長、CDS 和蛋白序列。在植物基因組網站JGI（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）分別下載番茄和柑橘的CHS 基因成員序列。同時使用DNAMAN軟件對葡萄CHS基因成員的氨基酸序列進行多重比對，利用HMMER 在線軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）對葡萄CHS 基因成員進行結構域篩選，剔除不含特定結構域的基因。

1.3 葡萄CHS基因家族理化性質分析

利用ExPASy 在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析VvCHS 基因的理化性質。運用在線軟件WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）和Prabi 工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分別預測VvCHS 基因家族成員的亞細胞定位和a-螺旋、b-轉角和不規則卷曲等二級結構所占比例。

1.4 葡萄與其他物種CHS蛋白系統進化和共線性分析

將葡萄、擬南芥、柑橘和番茄4 個物種的CHS蛋白的氨基酸序列用ClustalX 2.1 比對，利用MEGA7 軟件構建系統進化樹，Bootstrap 值為1000。利用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制CHS 基因家族成員的基因結構圖。根據CHS 基因fasta 格式的總CDS 序列，利用DNAsp 軟件計算葡萄、柑橘、番茄和擬南芥CHS 基因的非同義突變率（Ka）和同義突變率（Ks），分析基因對之間的選擇壓。利用BAT（http：//www.infspire.org/）工具繪制葡萄、柑橘、番茄和擬南芥四者間的共線性關系。

1.5 葡萄CHS基因家族順式作用元件預測

下載VvCHS 基因成員起始密碼子上游2 kb 的序列作為啟動子區域，使用PlantCARE 軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子元件進行分析，并用TBtools統計作圖。

1.6 葡萄CHS基因家族的實時熒光定量分析

VvCHS 基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司在線設計（表1）并合成。TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit 和Primer-ScriptTM Ⅱ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit [TaKaRa，寶生物工程（大連）有限公司]試劑盒分別用于葡萄試管苗根、莖、葉RNA的提取和反轉錄。使用TaKa-Ra TB Green Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa Biotechnology）試劑盒和LightCycle? 96（Roche，瑞士）PCR儀進行實時熒光定量PCR（quantitative real- time PCR，qRT-PCR），反應體系總體積為20 mL，包括10 mL的2 × SYBR，1 mL cDNA，2 mL 上、下游引物，7 mL 的ddH2O。以VvGAPDH 基因（登錄號：CB973647）作為葡萄定量表達內部參照基因[19]，試驗3 次重復。采用2-DDCT[20]法對葡萄CHS基因家族的相對表達量進行分析。

1.7 VvCHS3 基因克隆與煙草瞬時轉化

1.7.1 VvCHS3 基因克隆 通過基因家族定量數據分析，篩選表達差異顯著的VvCHS3（GSVIVG01010590001），使用SnapGene 軟件設計帶有BamH Ⅰ酶切位點的特異性引物，VvCHS3-F：5-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGGCTTCAAT -TGAGGAAATTAGAA-3，VvCHS3-R：5-GGTGTCGACTCTAGAGGATCCATTAGAAACCATAGGAA-TGCTATGCA-3。以黑比諾葡萄cDNA為模板進行PCR 擴增，將回收產物與pCAMBIA1300-GFP 質粒進行連接，隨后將連接產物轉入DH5α 大腸感受態細胞，經菌液PCR 檢測后送上海生工測序，測序合適后，提取VvCHS3 質粒轉化農桿菌，并鑒定陽性農桿菌重組子用于后續的植物轉化試驗。

1.7.2 煙草瞬時轉化 將含有目的基因已培養好的農桿菌菌液5000 ×g 離心10 min，收集菌體。使用緩沖液（50 mL 滅菌蒸餾水+500 μL MES+200 μLMgCl2+75 μL As）將菌體重懸至OD600為0.7～0.8。使用2 mL一次性注射器將重懸的菌液從生長25 d左右的本氏煙草葉背打入，以空載體作為對照，并于25 ℃黑暗培養48 h后轉入正常光照下培養1 d。在注射有菌液的葉片上用手術刀切取0.2 mm × 0.2 mm鏡檢樣本，置于AX10 熒光倒置顯微鏡（ZEISS 公司，德國）下觀察拍照。

1.8 數據處理與統計分析

采用Excel 軟件統計試驗數據，處理間用單因素ANOVA檢驗下的鄧肯法（Duncun）進行顯著性差異分析，p＜0.05 代表顯著差異，并用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄CHS基因家族成員理化性質分析

從葡萄基因組中共鑒定出7 個CHS基因家族基因，根據其在染色體上的先后位置分別將其命名為VvCHS1～VvCHS7。通過氨基酸序列比對分析（圖1）發現，VvCHS 蛋白序列相似性為29.77% ，7 個VvCHS 均含CHS 基因家族特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL和4 個保守活性位點氨基酸殘基。由表2 可知，葡萄CHS基因家族成員分布在12、14、16、17和18 號染色體上，其中16 號染色體上分布最多。

VvCHS1 是編碼序列最長、氨基酸殘基數目最多、分子質量最大、等電點最小的成員，而VvCHS2 是全長序列和編碼序列最短、氨基酸殘基數目和分子質量最小的成員。葡萄CHS 基因家族成員理論等電點為5.61（VvCHS1）～8.86（VvCHS7），7 個成員中有4 個編碼酸性氨基酸。不穩定指數介于36.64（VvCHS7）～43.50（VvCHS2）之間，其中有5 個成員為穩定性蛋白。總平均親水性指數分布在-0.36（VvCHS1）～0.05（VvCHS2）之間，其中有6 個成員為親水性蛋白。

2.2 葡萄CHS蛋白系統進化關系與基因結構分析

利用葡萄與擬南芥、柑橘和番茄CHS蛋白構建系統發育樹，發現4 個物種26 個蛋白可聚類為3 個亞族。GroupⅠ由7 個CitCHS 蛋白、4 個SlCHS 蛋白、4 個VvCHS 蛋白和1 個AtCHS 蛋白聚為1 個亞族。Group Ⅱ有2 個VvCHS 蛋白和2 個AtCHS 蛋白。Group Ⅲ由VvCHS1 蛋白和5 個AtCHS 蛋白組成，表明VvCHS1、VvCHS6 和VvCHS7 蛋白與擬南芥AtCHS 蛋白有較高的同源性（圖2）。26 個CHS基因家族成員中，除AtCHS2 和AtCHS5 基因只有1個外顯子、AtCHS8 基因有13 個外顯子外，其余CHS基因外顯子數在2～6 個之間，其中有12 個基因包含2 個外顯子和1 個內含子。結果表明，同一亞族不同基因之間基因結構相似，親緣關系較近。

進化選擇壓主要通過非同義突變率和同義突變率的比值（Ka/Ks）進行分析。本研究結果顯示，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 與AtCHS3 基因之間，VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 與AtCHS6 基因之間，VvCHS6 與AtCHS8、CitCHS7 基因之間，VvCHS1與SlCHS1、SlCHS2、SlCHS4 基因之間的Ka/Ks 值大于1，進行正向選擇，其余基因對之間均為純化選擇關系，所有成員之間均不存在中性進化關系（表3）。

2.3 葡萄CHS蛋白亞細胞定位預測及蛋白質二級結構分析

亞細胞定位預測結果顯示，有5 個VvCHS蛋白在細胞質、細胞膜和細胞核中表達，在線粒體和葉綠體中只有4 個蛋白表達（表4）。在過氧化物酶體中表達的有VvCHS3、VvCHS4 和VvCHS5 蛋白。在液泡中表達的只有VvCHS2 和VvCHS3 蛋白。VvCHS6 蛋白只在葉綠體和線粒體中表達，VvCHS7蛋白只在細胞膜中表達。

蛋白質二級結構預測分析結果表明，葡萄CHS基因家族編碼的蛋白質二級結構以α-螺旋結構（占比44.13% ～51.33%）和不規則卷曲結構（ 占比30.62%～37.40%）為主，β- 轉角結構占比（3.73～7.49%）較小（表4）。

2.4 葡萄CHS基因啟動子上游2 kb 順式作用元件分析

為進一步了解葡萄CHS 基因家族的生物學功能，對其進行順式作用元件預測，發現該基因家族主要包含與激素調節和逆境脅迫相關的順式作用調控元件，包括MeJA 響應元件（TGACG-motif）、脫落酸響應元件（ABRE）、SA 響應元件（TCA-element）、干旱響應元件（MBS）和低溫響應元件（LTR）等多種調控元件。這表明葡萄CHS 基因家族大部分成員可能同時響應多種逆境脅迫和激素調控（圖3）。另外，葡萄CHS 基因家族部分基因還包含生長素、GA3、光反應和厭氧誘導相關調控元件，可能與其相應的調控相關。

2.5 葡萄與柑橘、番茄、擬南芥共線性基因分析

共線性關系分析結果顯示，葡萄與柑橘、番茄和擬南芥CHS 基因家族基因之間都不存在共線性關系（圖4）。葡萄7 個CHS 成員中只有3 對基因之間（VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4與VvCHS5）存在共線性關系，柑橘8 個CHS 成員中只有4 對基因（CitCHS3 與CitCHS7、CitCHS3 與CitCHS5、CitCHS4 與CitCHS5、CitCHS5 與CitCHS7）之間存在共線性關系。經推測，這7個基因VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 以及CitCHS3、CitCHS4、CitCHS5、CitCHS7 可能是由基因復制產生的，且CHS 基因家族的基因復制事件只發生在物種基因組內部，在不同的物種之間未發生。

2.6 葡萄CHS基因家族的qRT-PCR分析

2.6.1 葡萄不同組織中VvCHS 基因的表達分析 qRT-PCR 分析結果顯示，VvCHS1 基因在葉中表達水平最高，相對表達量是根的1.2 倍。VvCHS6 在根中表達水平最高，在葉中表達水平最低。其余5 個VvCHS 基因在根中相對表達量最高，葉中次之，莖中相對表達量最低，具有明顯的組織特異性（圖5）。

2.6.2 激素誘導下葡萄CHS 基因家族在葡萄根、莖、葉中的表達 在不同激素處理下，對葡萄CHS基因家族進行qRT-PCR分析，發現葡萄根、莖、葉經MeJA 和SA 誘導后，VvCHS 基因上調表達，其中以VvCHS3 上調表達最為顯著，在根、莖和葉中相對表達量分別為對照的16.4、31.2、36.1 倍和40.3、44.3、25 倍（圖6）。

在MeJA 處理下，VvCHS2 和VvCHS4 基因在根中的表達水平高于莖和葉，其余基因在葡萄葉中的表達水平高于根和莖。在SA誘導后，VvCHS3 基因在莖中的表達水平高于根和葉，VvCHS4 基因在根和葉中的表達水平較高，在莖中表達水平較低，其余基因在根中的表達水平最高。NAA 誘導后，VvCHS2 基因在根和葉中的表達水平較低，在莖中表達水平較高。GA3誘導后，VvCHS1 和VvCHS3 基因在葉片中的表達水平顯著高于根和莖。VvCHS6基因只在葡萄根組織經SA 誘導后上調表達，為對照的1.23 倍。這表明在不同激素誘導下，VvCHS 基因在葡萄不同組織中的表達水平不同，VvCHS 基因可能參與MeJA和SA的信號傳導途徑，響應激素調控。

2.6.3 非生物脅迫下葡萄CHS基因家族在葡萄根、莖、葉中的表達 在非生物脅迫處理下，對VvCHS基因在葡萄不同組織中的表達模式進行分析，發現在4 ℃ 處理下，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4 和VvCHS7 基因在根中的表達水平最高，在莖中的表達水平最低。以VvCHS4 基因在葡萄根中上調表達最為顯著，相對表達量為對照的53.4 倍。VvCHS6基因在葡萄葉片中的相對表達量高于根，VvCHS3和VvCHS5 基因在葉片中的表達水平低于莖（圖7）。

在NaCl 處理下，VvCHS1、VvCHS4、VvCHS5 和VvCHS6 基因在根中的表達水平最高，其中VvCHS1和VvCHS6 基因在莖中的表達水平最低，VvCHS4 和VvCHS5 基因在葉片中的表達水平最低。VvCHS5基因在根中上調表達最為顯著，相對表達量為對照的30.6 倍。在PEG 處理下，VvCHS4 基因在根、莖、葉中的相對表達量最高，分別為對照的24.4、11.7 和13.3 倍。VvCHS1、VvCHS2 和VvCHS3 基因在莖中的表達水平高于根和葉。

葡萄根、莖、葉在NaCl、4 ℃和PEG 處理下，除VvCHS2 和VvCHS6 基因的相對表達量顯著下調表達外，其余基因均上調表達，說明在不同非生物脅迫下，不同組織器官中VvCHS 基因的表達水平有差異，VvCHS基因響應葡萄高鹽、低溫和干旱脅迫。

2.7 VvCHS3 煙草瞬時轉化

通過農桿菌介導法將35S：：VvCHS3：：GFP 導入本氏煙草葉片下表皮細胞內，進行瞬時表達分析，結果顯示注射空載35S：：GFP 的整個細胞發綠色熒光，而注射35S：：VvCHS3：：GFP 的本氏煙草葉片在細胞核和細胞膜上有綠色熒光。試驗證明VvCHS3 基因定位在細胞核和細胞膜中（圖8），該結果與亞細胞定位預測結果一致。

3 討論

CHS是植物體類黃酮合成路徑中的關鍵酶，也是與苯丙酮代謝有關的基因。筆者在本研究中從葡萄基因組中鑒定出7 個CHS基因，與擬南芥、柑橘和番茄CHS基因進行系統進化和選擇壓力分析，運用qRT-PCR分析不同激素誘導和非生物脅迫下該基因家族成員的組織表達特異性和不同處理下的表達情況，明確該家族基因在響應激素和非生物脅迫時的分子機制。到目前為止，已從矮牽牛（Petunia hybridaVilm.）、白木香（Aquilaria sinensis）等物種中分離鑒定出了CHS基因[21-22]。雙子葉植物中CHS基因家族數目較多，其中番茄中有8 個CHS基因[14]，辣椒（Capsicum annuum）中有7 個CHS 基因[23]。大多數單子葉植物含有2 個或3 個CHS基因。而在葡萄中鑒定到7 個VvCHS 基因。由此可見，不同物種中的CHS基因在數量上存在差異，這可能與基因組大小和物種的進化有關。VvCHS基因不均勻分布于5 條不同的染色體上，其中有3 個基因均分布于第16 條染色體上。VvCHS 基因家族等電點值表明，該基因家族只有1 種中性蛋白質（VvCHS5），有2 種堿性蛋白質（VvCHS6 和VvCHS7）。根據遺傳距離筆者將CHS 蛋白劃分為3 大亞族，其中Group Ⅱ和GroupⅢ均由葡萄VvCHS蛋白和擬南芥AtCHS 蛋白聚類為一族，說明葡萄與擬南芥CHS 之間同源關系較近。葡萄CHS 基因與其他3 個物種CHS 基因之間主要進行純化選擇，葡萄中僅VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4 與VvCHS5 之間具有共線性關系，柑橘中僅CitCHS3 與CitCHS7、CitCHS3與CitCHS5、CitCHS4 與CitCHS5、CitCHS5 與CitCHS7 之間具有共線性關系。通過共線性分析結合基因的結構、進化分析發現，VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5、CitCHS3、CitCHS4、CitCHS5、CitCHS7 的基因結構高度相似，這7 個基因分布在同一個亞家族，基因之間親緣關系相近，說明這些基因是在同一物種內由于基因復制而分離的同源基因。因此推測這幾個基因可能是由基因復制產生的。

趙偉等[24] 發現紅仁核桃（Juglans regia L.）JrCHS 蛋白主要分布于細胞質。章妮等[25]研究表明毛竹（Phyllostachys edulis）CHS 蛋白主要定位于內質網，少數定位于細胞質。何夢媛等[26]通過亞細胞定位預測發現甘草（Glycyrrhiza uralensis）GuCHS蛋白主要在細胞質中發揮作用。本研究亞細胞定位預測顯示，葡萄CHS 蛋白主要定位于細胞質、細胞膜和細胞核中，煙草瞬時轉化顯示VvCHS3 基因定位于細胞核和細胞膜上，與預測結果相符，表明CHS基因可能大多在細胞質中起作用，但是不同物種CHS 基因家族成員在細胞器中的分布也存在一定差異。對葡萄CHS 基因家族進行蛋白質二級結構預測發現，VvCHS蛋白二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主，β-轉角則相對較少，這一結果與趙偉等[24]分析紅仁核桃CHS蛋白的研究結果一致。

CHS 基因的表達與器官形態建成、功能分化有著密切關系，由于表達模式的差異，使其表達具有組織特異性。張變玲等[7]研究結果表明人參（Panax ginseng C.）CHS 基因主要在葉片中表達。梅志棟等[27]研究表明杧果（Mangifera indica）CHS1基因的相對表達量在葉和花中較高。而本研究表明，葡萄CHS 基因主要在根中表達，也有個別基因在葉片中表達水平最高，如VvCHS1 基因在葉片中的相對表達量是根的1.2 倍。除VvCHS6 基因在莖中的相對表達量高于葉片外，該基因家族其余成員在莖中的表達水平最低。這與前人的研究結果有相似之處，但是也存在一定的差異，表明不同物種CHS基因家族成員在不同組織中的表達水平不盡相同。順式作用元件預測發現，葡萄CHS基因家族成員的啟動子序列中含有與激素、非生物脅迫相關的調控元件，這與趙偉等[24]的研究結果一致。

研究發現，泡核桃（Juglans sigillata）JsCHS1 基因在低溫處理6 h 后上調表達，說明JsCHS1 基因可響應低溫脅迫[28]。秋茄（Kandelia candel）KcCHS 基因的相對表達量隨著鹽脅迫的增強呈極顯著上升趨勢，這與秋茄抵抗鹽脅迫的能力有關[29]。馬立功等[8]研究向日葵（Helianthus annuus）HaCHS基因的逆境應答，發現經SA 和ABA 誘導后，HaCHS 基因的相對表達量變化不顯著。王海波等[30]通過半定量RTPCR分析說明JcCHS 基因在小桐子（Jatropha curcas）中響應低溫。本研究通過qRT-PCR 分析表明，在不同外源激素誘導和非生物脅迫條件下，VvCHS基因家族成員在葡萄根、莖、葉中均有表達。在5mmol · L-1 SA 誘導下，VvCHS1 和VvCHS7 基因在葡萄根中顯著上調表達，其相對表達量分別為對照的21 倍和15.3 倍；VvCHS3 在葡萄莖中的相對表達量最高，為對照的44.3 倍。這與張變玲等[7]的研究結果一致，與馬立功等[8]的研究結果不符，說明CHS基因在不同植物中可能具有不同的表達模式，存在不同的調控機制。在0.2 mmol · L- 1 ABA 誘導下，VvCHS 基因的相對表達量與對照并無顯著差異，且該處理下VvCHS基因的表達水平最低，說明VvCHS基因對ABA誘導不敏感，可能沒有參與ABA信號傳導途徑的調控。在0.1 mmol · L- 1 MeJA 誘導下，VvCHS 基因家族成員除VvCHS6 呈下調表達外，其余基因均上調表達，在葡萄葉片中，VvCHS3 的相對表達量最高，為對照的36.1 倍，說明VvCHS 基因受MeJA誘導而上調表達，這與前人的研究結果一致。葡萄在400 mmol·L-1 NaCl、4 ℃和10% PEG脅迫下，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 和VvCHS7 基因均上調表達，其中以VvCHS4 基因上調表達最為顯著，說明VvCHS 基因參與鹽脅迫、低溫誘導和干旱脅迫，這與前人研究結果一致。以上結果表明VvCHS 基因家族的大多數成員受MeJA、SA、ABA和各種非生物脅迫調節的影響，說明VvCHS基因家族在葡萄逆境脅迫應答中起作用。

4 結論

本研究基于葡萄基因組數據庫共鑒定出7 個VvCHS 基因家族成員，分布于5 條不同染色體上。分析發現VvCHS基因家族有4 個成員為酸性蛋白，5個成員為穩定性蛋白，6 個成員為親水性蛋白。蛋白質二級結構均以α-螺旋和無規卷曲為主。該基因家族啟動子區域包括低溫、干旱及激素響應元件。煙草瞬時表達證明VvCHS3 基因定位在細胞核和細胞膜。qRT-PCR結果表明，該基因家族參與水楊酸和茉莉酸甲酯等外源激素的調控，同時響應低溫、干旱和高鹽脅迫。

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