胃癌組織內miR-34a與miR-27b表達及其抑制胃癌生長與血管生成的機制

楊向超 李昌偉 周曉華 李合

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科,海南 海口 570102)

近年來,隨著衛(wèi)生和飲食習慣的改善,胃癌的發(fā)病率已逐漸降低,但該疾病仍是全球第五大常見的癌癥類型,每年有100萬以上的新病例出現且導致78萬例患者發(fā)生死亡〔1〕。胃癌的高死亡率主要歸因于缺乏精確的早期診斷標準及無效治療〔2〕。目前,手術治療、免疫治療和靶向治療是胃癌治療的主要手段,然而,多數患者在進行手術治療生存率和預后不佳。而腫瘤細胞獲得性或原發(fā)性耐藥的產生也使得多數接受化療的患者預后很差〔3〕。

近年來,微小RNA(miRNA)已成為用于癌癥或其他疾病診斷研究的重點內容。miRNA在體液中穩(wěn)定存在,能夠被外泌體所覆蓋,因此不會被內源性RNA降解酶(RNase)所破壞〔4〕。miRNA是長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA,其主要功能是抑制或促進細胞內特異性基因的表達,進而調節(jié)細胞的增殖、侵襲和遷移等過程。miR-34a位于人類染色體抑癌區(qū)域1p36.23,其表達受到P53信號通路調節(jié);miR-27b則是位于C9orf3基因第14個內含子,以往研究表明,miR-34a和miR-27b參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié),包括細胞周期、分化、轉移及黏附等〔5～8〕。血管內皮生長因子(VEGF)是缺氧誘導的促血管生成因子,其受體包括VEGFR-1/2/3,屬于受體酪氨酸激酶,主要分布在內皮細胞、骨髓源細胞和神經元細胞膜中。其中,VEGFR-2幾乎介導所有的VEGF誘導血管生成作用,在血管生成過程中,磷酸化的VEGFR2啟動下游信號傳導級聯反應,涉及細胞存活、生長和遷移等多個細胞過程〔9,10〕。本研究檢測胃癌組織及癌旁組織中miR-34a、miR-27b的表達,通過體介導法過表達兩個miRNA觀察胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及血管生成的變化情況,并初步探索其在胃癌生長和轉移中的分子機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集 收集15例胃癌組織及距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁組織,均為海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2018年12月至2020年6月胃癌手術切除標本,其中男11例,女4例,年齡25～72歲,平均(48.0±4.45)歲。大體分型為:潰瘍型4例,浸潤潰瘍型7例、彌漫浸潤型4例;分化程度為:低分化8例、中分化4例、高分化3例;TNM分期為:Ⅰ級2例、Ⅱ級5例、Ⅲ級7例、Ⅳ級1例。患者術前均未接受化療及放療,且臨床資料完整,未有合并其他腫瘤者。所有病例標本由2位專業(yè)病理科大夫診斷,患者及家屬均簽署知情同意書,本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與材料 人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司,Trizol試劑盒購自南京諾維贊生物公司,miRNA逆轉錄試劑盒和實時熒光定量 qPCR試劑盒購自Genecopoeia公司,免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德生物公司,Lipofectamine3000轉染試劑盒購自美國Promega公司,CCK-8和EdU試劑盒購自杭州四季青公司,Transwell小室購自康寧公司,VEGF與VEGFR2酶聯免疫試劑盒購自南京凱基生物公司,雙熒光素酶試劑盒、基質膠膠、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和電化學發(fā)光(ECL)液購自上海碧云天生物研究所,兔抗人VEGF,兔抗人KDR、兔抗人FLK-1購自英國Abcam公司,鼠抗人β-actin和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔購自上海昊鑫生物公司,野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突變型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF 3′-UTR質粒載體及引物序列均由上海生工生物工程公司構建合成。

1.3方法

1.3.1胃癌組織及癌旁組織miR-34a、miR-27b的檢測 使用Trizol試劑從研磨破碎的胃癌組織及癌旁組織中抽提總RNA,紫外分光光度計檢測RNA純度與濃度,OD260/OD280值的范圍在1.8～2.0即為合理。根據 TaqMan? miRNA Reverse Transcription Kit將總RNA進行反轉錄獲取cDNA,接著利用TaqMan MiRNA Assays試劑盒進行實時熒光定量PCR實驗檢測各樣本組織中miR-23a和miR-27b的表達水平變化,以U6作為內參。反應條件為:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;擴增40次。實驗重復3次,擴增結束后,根據2-ΔΔCt法來計算miRNA的相對表達水平。具體引物序列:miR-34a上游引物:5′-GCCGCGGGGTTCCTGGGGAT-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;miR-27b上游引物:5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′;下游:5′-CAG TGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′;序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2胃癌組織及癌旁組織中VEGF表達的檢測 通過免疫組織化學染色方法檢測胃癌組織標本及癌旁組織標本VEGF表達。將組織固定好后,制備石蠟切片,脫蠟至水,0.3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育30 min,抗原高溫微波熱修復,10%山羊血清封閉非特異性位點,室溫孵育1 h,滴加兔抗VEGF(1∶200)一抗工作液,4 ℃孵育過夜。次日,滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液(1∶1 000),室溫孵育1 h,滴加二氨基聯苯胺(DAB)染色,蘇木素復染細胞核,二甲苯透明,封片,所有操作嚴格按照說明書進行。結果判斷:VEGF蛋白陽性表達定位于細胞膜或細胞質內,呈棕黃色。通過光學顯微鏡在低倍鏡(40倍)下選取細胞密集區(qū)域,隨機選取5個高倍視野(400倍)計數100個細胞,計算陽性細胞占總細胞的百分率。

1.3.3細胞分組與轉染 取對數生長期的SGC-7901細胞接種于12孔板內,每孔細胞數為1×105個,放在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合度達到80%以上,進行轉染實驗。實驗具體分組:①空白對照A組、miR-34a mimic組、miR-34a NC組;②空白對照B組、miR-27b mimic組、miR-27b NC組。將Lipofectamine3000分別與50 nmol/L miR-34a mimic、50 nmol/L miR-27b mimic及50 nmol/L對應的陰性對照轉染至SGC-7901細胞中,操作嚴格按照試劑盒說明書進行,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱轉染6 h 后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實驗。為保證轉染效果,轉染每2 d執(zhí)行1次。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖活性 SGC-7901細胞轉染后置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24、48、72 h時,每孔加入10 μl CCK-8試劑液,混勻后繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處吸光度值,實驗重復3次。

1.3.5EdU實驗檢測細胞增殖水平 SGC-7901細胞轉染后按1×105個/孔的密度接種在24孔板,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,隨后更換終濃度為10 μmol/L EdU的培養(yǎng)基培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄培養(yǎng)基,PBS洗滌細胞,滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min,棄固定液,加入甘氨酸孵育5 min,PBS洗滌后,使用0.5% Triton X-100穿透細胞膜10 min,PBS洗滌細胞,再加入Apollo567熒光染料室溫避光染色30 min,甲醇清洗細胞,接著加入Hoechst33342反應液,室溫避光孵育30 min,棄反應液,PBS清洗細胞后,甘油封片,利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況,其中藍色熒光為細胞核,紅色熒光為EdU陽性細胞。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 在24孔Transwell小室上室加入50 μl稀釋的基質膠,置于37 ℃待膠凝固。將轉染的SGC-7901細胞密度調整為2×104個/ml,吸取200 μl懸液加入Transwell 小室上室,下室加入600 μl含10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結束后取出小室,棄培養(yǎng)液并擦去上室細胞,在小室中加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色,PBS清洗多余染液,光學顯微鏡下觀察拍攝圖像,隨機選擇5個視野計數,計算細胞侵襲數目,結果取平均值。遷移實驗除不鋪基質膠外,其他步驟均與上述侵襲實驗相同。

1.3.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液VEGF、VEGFR2水平 SGC-7901細胞轉染后培養(yǎng)48 h,收集細胞上清,以4 000 r/min離心5 min,吸取等量的上清于離心管。按照VEGF與VEGFR2的酶聯免疫試劑盒說明書檢測細胞上清中VEGF、VEGFR2的濃度,操作嚴格按照試劑盒說明書步驟執(zhí)行。

1.3.8熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-34a、miR-27b與VEGF的靶標關系 通過生物信息學工具TargetScan7軟件,并參考VEGF 3′-UTR序列,預測miR-34a、miR-27b與VEGF 3′-UTR結合的靶位點序列,設計并合成野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突變型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF的3′-UTR質粒載體。將對數生長期的SGC-7901細胞以1×105個/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng),使用 Lipofactamine3000分別將miR-34a mimic、miR-27b mimic或對應的陰性對照聯合構建好的WT-VEGF 3′-UTR 質粒載體或MUT-VEGF 3′-UTR質粒載體轉染到SGC-7901細胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,PBS沖洗細胞,加入裂解液裂解細胞,根據雙熒光素酶試劑盒操作說明書,檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3.9Western印跡檢測細胞中KDR、FLK-1蛋白表達 收集轉染后SGC-7901細胞,PBS清洗后加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,通過BCA法測定蛋白質含量。取等量各組蛋白樣品30 μg加樣,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,TBST洗膜,接著加入兔抗KDR(1∶300)、FLK-1(1∶300)一抗工作液,以鼠抗β-actin作為內參蛋白(1∶5 000),4 ℃下孵育過夜;次日,棄一抗工作液,TBST洗膜,加入對應辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL液顯色3 min,凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image Pro-Plus系統(tǒng)分析各蛋白條帶的灰度值,計算各蛋白的相對表達水平。

1.3.10靜脈內皮細胞的成管實驗 將稀釋后的基質膠加入24孔板中,置于37 ℃孵育1 h,待膠凝固形成基質膜。取對數生長期的HUVECs,消化后,將濃度調整為5×106個/ml,取200 μl細胞懸液接種于鋪好基質膠的24孔板,分別加入轉染后培養(yǎng)48 h的SGC-7901細胞上清液培養(yǎng),置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,終止培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察HUVECs成管情況。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌組織及癌旁組織miR-34a、miR-27b表達比較 胃癌組織中miR-34a(1.00±0.05)與miR-27b的相對表達水平(1.00±0.06)均顯著低于癌旁組織中的表達水平(3.02±0.31,3.11±0.34),差異具有統(tǒng)計學意義(t=38.524、26.981,均P=0.000)。

2.2胃癌組織及癌旁組織VEGF表達比較 免疫組織化學染色結果可見,胃癌腫瘤組織細胞胞質內出現棕黃色染色,癌旁組織內染色較淺,細胞著色較少,胃癌組織VEGF陽性表達率顯著高于癌旁組織VEGF陽性表達率〔(38.0±4.2)% vs (11.3±0.89)%;t=34.152,P<0.01〕,見圖1。

圖1 免疫組織化學染色檢測胃癌組織及癌旁組織VEGF表達(×400)

2.3轉染后SGC-7901細胞miR-34a、miR-27b表達比較 與空白對照A組(1.00±0.09)比較,miR-34a mimic組細胞miR-34a相對表達水平(3.1±0.43)顯著升高(P<0.01),miR-34a NC組細胞miR-34a表達(1.06±0.09)變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與空白對照B組(1.00±0.06)比較,miR-27b mimic組細胞miR-27b相對表達水平(2.4±0.34)顯著升高(P<0.01),而miR-27b NC組(1.00±0.08)變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.4轉染后SGC-7901細胞增殖比較 在轉染48 h和72 h后,miR-34a mimic組SGC-7901細胞活性較空白對照A組顯著下降(P<0.01),miR-34a NC組與空白對照A組細胞活性之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-27b mimic組細胞活性較空白對照B組也顯著下降(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組之間的變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。miR-34a mimic組〔(43.46±2.23)%〕細胞活性較空白對照A組〔(81.38±4.6)%〕顯著下降(P<0.01),miR-34a NC組〔(79.36±4.6)%〕與空白對照A組細胞活性之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白對照B組〔(62.1±4.5)%〕比較,miR-27b mimic組細胞活性〔(24.86±2.1)%〕顯著下降(P<0.01),而miR-27b NC組(59.36±4.6%)變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見圖2。

表1 各組細胞增殖、遷移與侵襲及SGC-7901細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量比較

圖2 各組細胞增殖活性(EdU染色,×100)

2.5轉染后SGC-7901細胞遷移與侵襲比較 與空白對照A組比較,miR-34a mimic組細胞遷移與侵襲數目均顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組細胞遷移與侵襲數目變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白對照B組比較,miR-27b mimic組細胞遷移與侵襲數目均顯著減少(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組細胞的遷移與侵襲數目無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表1、圖3。

圖3 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲(結晶紫染色,×100)

2.6轉染后細胞上清液VEGF、VEGFR2水平比較與空白對照A組比較,miR-34a mimic組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量均顯著降低(P<0.01),miR-34a NC組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量較空白對照A組的變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與空白對照B組比較,miR-27b mimic組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量也均顯著降低(P<0.01),miR-27b NC組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量較空白對照B組的變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

2.7miR-34a、miR-27b靶向VEGF關系驗證 通過TargetScan7預測發(fā)現,miR-34a、miR-27b均與VEGF 3′-UTR在特定區(qū)域存在堿基互補現象,見圖4。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,與miR-34a NC和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組比較,miR-34a mimic和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值顯著降低(P<0.01);同樣,miR-27b mimic和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值較miR-27b NC和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組顯著降低(P<0.01),見表2。

表2 各組SGC-7901細胞相對熒光值比較

圖4 miR-34a、miR-27b與VEGF 3′-UTR靶向結合位點

2.8轉染后細胞KDR/FLK-1蛋白表達比較 miR-34a mimic組SGC-7901細胞中KDR、FLK-1蛋白表達較空白對照A組中顯著降低(P<0.01),miR-34a NC組與空白對照A組的KDR、FLK-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-27b mimic組細胞中KDR、FLK-1蛋白表達較空白對照B組中顯著降低(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組中兩種蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖5、表3。

表3 Western印跡檢測細胞中KDR、FLK-1蛋白表達

1～6:空白對照A組、miR-34a NC組、miR-34a mimic組、空白對照B組、miR-27b NC組、miR-27b mimic組

2.9各處理組靜脈內皮細胞的成管結果比較 與空白對照A組〔(36.38±4.73)個〕比較,miR-34a mimic組細胞形成小管數目〔(17.46±1.84)個〕顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組細胞小管數目〔(35.17±6.16)個〕無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。miR-27b mimic組中細胞形成小管數目〔(9.87±1.35)個〕較空白對照B組〔(29.10±3.95)個〕顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組〔(30.13±4.68)個〕與空白對照B組的細胞小管數目之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見圖6。

圖6 各組靜脈內皮細胞成管情況(×100)

3 討 論

胃癌的病理過程涉及各種基因、因子和信號途徑參與,遺傳變異導致正常細胞的結構和功能發(fā)生不可逆轉的變化,最終導致癌變發(fā)生。胃癌發(fā)展有多個步驟,且這些步驟已通過病理和流行病學研究確定,在大多數情況下,最初階段是慢性胃炎,其次發(fā)展為胃萎縮和胃黏膜腸化生細胞變性,最終發(fā)展為胃癌〔2〕?；蜻z傳、吸煙、飲酒和不良飲食習慣均可能引發(fā)胃癌。目前,病理學診斷、物理學診斷和血清學檢查是常規(guī)的癌癥診斷方法〔11〕,隨著醫(yī)療技術的進步,出現了以細胞變化為中心的基因診斷方法,旨在早期檢測出從正常表型細胞轉化為癌細胞的證據。

目前,miRNA已成為一類新型潛在生物標志物用于微創(chuàng)診斷和疾病監(jiān)測中。miR-34a和miR-27b是多種腫瘤進展的獨立預測因子。miR-34a表達水平與肝癌、乳腺癌、結直腸癌、膀胱癌的惡性程度呈負相關,miR-34a下調后削減了P53介導的促進細胞凋亡作用。此外,miR-34a還可以通過靶向相關分子來影響癌細胞的增殖和侵襲,例如Shen等〔12〕不僅證明了miR-34a在喉鱗狀細胞癌中的低表達,而且發(fā)現轉染miR-34a mimic可以通過靶向下調survivin蛋白顯著抑制細胞的增殖,使細胞發(fā)生G0/G1階段阻滯;Geng等〔13〕研究發(fā)現,過表達miR-34a可通過靶向調節(jié)E2F3和存活素(survivin)的表達來降低人乳頭瘤病毒陽性宮頸癌細胞的生存能力和轉移能力。miR-27b也在多種癌癥類型中起著復雜的作用,調節(jié)一系列生物學過程;Zhang等〔14〕研究發(fā)現miR-27b在非小細胞肺癌中表達水平降低,通過靶向鋅指轉錄因子(Snail)1發(fā)揮抑癌作用,以抑制肺癌的生長和上皮間質轉化。已有研究表明,miR-27b在胃癌組織和細胞中均下調,而TNM分期較高且腫瘤較大的患者組織中miR-27b表達水平較低,miR-27b能夠通過靶向核受體亞家族2F組成員(NR2F)2抑制胃癌轉移〔15〕。本研究結果同樣顯示,miR-34a與miR-27b在胃癌組織中呈低表達,通過轉染mimic在胃癌細胞中過表達miR-34a與miR-27b后可顯著抑制腫瘤細胞增殖與轉移。由此進一步表明,miR-34a與miR-27b可能在胃癌進程中起著抑癌基因的作用。

胃癌組織中強大的血管生成能力顯著促進了腫瘤的生長與轉移過程,這也是胃癌具有高死亡率的重要原因之一,鑒定胃癌血管生成的分子機制并研發(fā)新的抗血管生成靶標藥物對于患者來說意義重大。

研究表明,腫瘤細胞中VEGF與其受體VEGFR2結合后會激活酪氨酸激酶,促進受體磷酸化和相關信號轉導機制來刺激血管生成,從而增強組織中的血管生長并維持血液供應〔9,16〕。腫瘤細胞分泌的VEGF以旁分泌的方式通過與內皮細胞上VEGFR相互作用而刺激血管生成。然而,源自腫瘤細胞的VEGF也起自分泌因子的作用以調節(jié)細胞一系列生物學行為〔17〕。

本研究結果顯示,VEGF在胃癌組織中高表達,而在胃癌細胞中轉染miR-34a mimic或miR-27b mimic后,細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量降低。結合生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告分析得到miR-34a與miR-27b靶向調控VEGF表達。目前,已發(fā)現多個miRNA通過靶向VEGF發(fā)揮作用,例如:miR-101通過抑制環(huán)氧化物酶(COX)-2衍生的前列腺素(PG)E2信號傳導靶向VEGF來抑制膽管癌的血管生成〔18〕;miR-182-5p通過靶向VEGF并抑制細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT)信號通路,以此調節(jié)血管生成和淋巴管生成來抑制結腸癌腫瘤的生長〔19〕。本研究結果顯示,轉染miR-34a mimic或miR-27b mimic的細胞中KDR、FLK-1蛋白表達水平降低,HUVECs細胞形成小管數目減少。由此推測,miR-34a 與miR-27b通過靶向VEGF/VEGFR2軸來發(fā)揮抑制血管生成的作用。

綜上所述,miR-34a與miR-27b在胃癌組織中低表達,兩者能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移與侵襲,并且具有抑制血管內皮細胞小管形成的能力。VEGF是miR-34a與miR-27b的共同靶標基因,miR-34a與miR-27b可能通過調控VEGF/VEGFR2軸發(fā)揮相關抑制作用。miR-34a與miR-27b可能為胃癌潛在的治療靶點,本研究為以后該疾病的診治研究提供新的切入點。