解耦聯蛋白2對膿毒癥腹腔感染大鼠心肌細胞凋亡、氧化應激及PKR/Caspase-11蛋白的影響

陳群 李霖 李秀娟 何德劍 王逸君

(郴州市第一人民醫院,湖南 郴州 423000)

膿毒癥是感染所致的全身炎癥反應綜合征〔1〕。膿毒癥從本質上是對感染性因素的反應,其可由任何部位的感染引起,臨床上常見于肺炎、膿腫、泌尿系統感染等〔2〕。膿毒癥患者一般會出現心肌功能障礙,心肌功能障礙是相關的膿毒癥患者死亡率增加的主要因素,其中心血管系統介導膿毒癥的發生、發展〔3〕。目前研究認為,膿毒癥心肌損傷的主要機制有內毒素炎癥因子誘導、線粒體功能抑制、氧化應激、微循環障礙和細胞凋亡等〔4〕,其中線粒體功能抑制和氧化應激損傷的作用在臨床上備受關注。解耦連蛋白(UCP)2是線粒體陰離子通道家族的一員,在心、肺和腦等組織中廣泛分布,介導多種病理生理過程〔5〕。有學者研究發現動脈粥樣硬化的發生發展和UCP2有密切聯系,且其介導多種病理生理過程,例如免疫應答反應、食物的攝入和多種代謝性疾病〔6〕。體外研究顯示,UCP2上調可以通過調控膜電位進而保護神經元,而UCP2基因敲除則會導致線粒體活性氧產生明顯增多以致損害神經元〔7〕。對于心肌細胞,尤其在膿毒癥狀態下的心肌細胞中UCP2的作用近年來報道較少。鏈RNA依賴的蛋白激酶(PKR)是蛋白激酶的一種,在免疫應答、心肌細胞等方面具有明顯作用〔8〕。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-11早期以單體形式存在,活化條件下形成二聚體和剪切體。一旦Caspase-11被剪切,其就成為對病原體刺激產生固有免疫的重要媒介〔9〕。有研究表明,Caspase-11的激活能夠導致一種特殊的細胞死亡方式,被成為細胞焦亡,細胞焦亡在膿毒癥的過度免疫中扮演十分重要的角色〔10〕。目前還沒有研究證實PKR和Caspase-11在膿毒癥的表達情況,因此本研究對膿毒癥腹腔感染大鼠模型給予UCP2干預,觀察期對模型大鼠心肌細胞凋亡、氧化應激及PKR/Caspase-11蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只SD大鼠均從遼寧長生生物技術有限公司購買〔許可證號:SCXK(遼)2010-0001〕。清潔級,雌、雄各半,體質量180～200 g。適宜溫、濕度(24 ℃,自由飲水攝食)的環境中對大鼠適應性喂養7 d。

1.2試劑和儀器 UCP2膜擬物(mimics)慢病毒載體、UCP2腺相關病毒AAV-UCP2(漢恒公司);PKR抗體、Caspase-11抗體(美國Abcam公司);水合氯醛(上海國藥集團);組織強效裂解液RIPA(美國Solarbio公司);小動物呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司);離心機(凱特實驗儀器有限公司);熒光顯微鏡(上海通灝光電科技有限公司)。

1.3實驗分組 按照數字隨機法將大鼠分為假手術(Sham)組、盲腸結扎穿孔術(CLP)致膿毒癥模型(CLP)組、單純腺相關病毒(AAV)組、UCP2過表達手術(UCP2)組各20只。Sham組行等量生理鹽水替代病毒轉染手術,3 w后模擬CLP,但開腹后不進行盲腸結扎及穿孔,手術結束后還納盲腸至原位,關腹;CLP組行等量生理鹽水替代病毒轉染手術,3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型;AAV組行單純AAV病毒心肌轉染,無目的基因的表達,3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型;UCP2組行AAV-UCP2病毒心肌轉染,3 w后建立CLP致膿毒性心肌損傷模型。

1.4心肌轉染模型建立 各組大鼠進行心肌病毒轉染。麻醉大鼠后固定,暴露胸部,氣管插管,鏈接小動物呼吸機。以心尖部為中心,做一斜行切口,依次鈍性分離肌肉,于第4、5肋間放置小動物開胸器暴露心臟后立即注射AAV-UCP2病毒(滴度為1×1012μg/ml)10 μl,注射6點,共60 μl。撤出開胸器后,加大通氣量,充分膨脹肺,將胸腔積血積氣排空后縫合。觀察呼吸、心跳,穩定后拔管肌肉注射100 kU青霉素,連續3 d,預防感染。3 w后冰凍切片心肌組織,熒光顯微鏡下觀察,并用Western印跡驗證UCP2的表達水平,評價病毒轉染情況。

1.5膿毒癥模型制備 采用CLP制備膿毒癥模型〔11〕。麻醉大鼠,仰臥位固定消毒手術部位,沿腹部正中線做一個長約1.5 cm的切口,剪開皮膚和肌層,探查腹腔并找到盲腸,避免損傷腸系膜血管。把盲腸末端1/3處進行結扎,用穿刺針穿刺兩次形成2個盲腸漏,輕輕擠出少許糞便。將盲腸還納腹腔,逐層縫合腹壁切口。Sham組不進行盲腸結扎,其他步驟同其他3組。術后大鼠均皮下注射2～3 ml/kg的生理鹽水,分籠飼養。膿毒癥成功標準:大鼠活動減少,蜷縮,嗜睡,立毛,口鼻、眼角分泌物增多。

1.6標本采集 術后24 h麻醉大鼠,開胸,取心臟血5 ml置于離心管中,室溫靜置3～4 h后見血凝塊析出,離心,獲得所需血清,放置于-20 ℃冰箱中待用。血標本獲取完畢后立即取出心臟,4 ℃鹽酸緩沖液漂洗,取左心室置于-80 ℃冰箱備用。

1.7Western印跡檢測心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達 取心肌組織置于冰上,剪碎組織,加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIPA進行勻漿。離心10 min后取上清,在蛋白樣品中加入緩沖液混勻,煮沸后進行電泳、轉膜和封閉,封閉后分別孵育兔抗UCP2、PKR和Caspase-11多克隆抗體和小鼠抗β-actin抗體,4 ℃搖床孵育過夜;洗滌緩沖液(TBST)室溫洗滌3次后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體和山羊抗小鼠IgG抗體,室溫1 h,經TBST洗滌、滴加化學發光試劑于曝光儀中拍攝蛋白顯影條帶,ImageJ軟件分析各組蛋白相對表達量。

1.8心肌組織病理形態學觀察 取大鼠心肌組織,甲醛固定后脫水,石蠟包埋組織后切片,厚度為5 μm,每組3張,切片行蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學變化。

1.9TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡率 心肌組織與蛋白酶K室溫孵育,將切片組織在TUNEL反應液中浸泡,后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。過氧化氫沖洗淬滅酶活性,后聯合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯苯胺覆蓋,光學高倍顯微鏡下進行觀察凋亡細胞核呈現棕黃色,每張切片隨機取5個清晰視野觀察。

1.10心肌組織丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 取10%左心室勻漿上清液,依次加入試劑盒中的試劑,充分混勻后,煮沸,10 min后離心取上清液,蒸餾水調零,于532 nm處測光密度(OD)值,用考馬斯亮藍法測定組織的蛋白含量,計算各組大鼠MDA含量。取各組大鼠左心室,將組織制成勻漿后離心,收集上清液。于440 nm下測定各組吸光度值。用考馬斯亮藍法測定組織的蛋白含量,計算各組大鼠SOD活性。

1.11統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1CLP模型建立及評價 模型制備1 d后,與Sham組相比,CLP組、AAV組及UCP2組大鼠均出現嗜睡、精神萎靡、活動明顯減少、蜷縮、立毛眼鼻口分泌增多,甚至出現膿尿、稀便及呼吸困難等癥狀。開腹后發現,盲腸呈紫黑色、腫脹、脆性增加,周圍腸腔有膿性滲出、惡臭,腸管與腹腔發生粘連。

2.2病毒轉染鑒定 注射病毒3 w后,冰凍切片,熒光顯微鏡下可見UCP2組心肌組織中UCP2病毒成功轉染,見圖1。

綠色熒光為UCP2病毒轉染成功

2.3各組UCP2蛋白表達比較 和Sham組相比,CLP組、AAV組和UCP2組心肌組織中UCP2表達明顯升高(P<0.05),且UCP2組中UCP2蛋白表達顯著高于CLP組和AAV組(P<0.05);AAV組和CLP組心肌組織中UCP2蛋白表達無明顯差異(P>0.05),見圖2、表1。

表1 各組心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達比較

圖2 各組心肌組織中UCP2、PKR、Caspase-11蛋白表達比較

2.4各組心肌組織中PKR、Caspase-11蛋白表達比較 CLP組和AAV組心肌細胞中PKR和Caspase-11蛋白表達無明顯差異(P>0.05);CLP組、AAV組、UCP2組心肌組織中PKR蛋白表達較Sham組明顯減少,Caspase-11蛋白表達較Sham組明顯增加(P<0.05);與CLP和AAV組相比,UCP2組心肌組織中PKR蛋白表達得到明顯回升,Caspase-11蛋白表達顯著降低(P<0.05),見圖2、表1。

2.5各組心肌組織病理學變化比較 與Sham組相比,CLP組心肌細胞出現水腫、間質充血、心肌纖維變性,橫紋模糊不清甚至消失,出現廣泛的肌纖維波浪狀排列;AAV組和CLP組心肌組織病理變化沒有顯著差異,基本一致;與CLP組相比,UCP2組心肌細胞有少量水腫,心肌纖維排列基本正常,病變程度得到看明顯的改善,見圖3。

圖3 各組心肌組織病理學變化(HE染色,×200)

2.6各組心肌細胞凋亡指數比較 Sham組心肌僅有少數視野偶見個別凋亡細胞,CLP組和AAV組、UCP2組細胞的凋亡指數明顯增加(P<0.05);CLP組和AAV組細胞凋亡指數比較沒有統計學意義(P>0.05);與CLP組和AAV組相比,UCP2組心肌細胞凋亡指數明顯降低(P<0.05),見圖4,表2。

表2 各組心肌細胞凋亡指數及MDA含量和SOD活性比較

圖4 各組心肌細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.7各組MDA含量和SOD活性比較 CLP組和AAV組MDA含量和SOD活性沒有顯著差異(P>0.05);CLP組、AAV組、UCP2組MDA含量較Sham組顯著升高,SOD活性較Sham組明顯降低(P<0.05);UCP2組MDA含量較CLP組和AAV組得到明顯抑制,SOD活性較CLP組得到顯著升高(P<0.05),見表2。

3 討 論

目前對于膿毒癥動物的造模主要集中在嚙齒動物,大致可分為外源性注射型:經靜脈、呼吸道或者腹腔直接注射活的細菌或者內毒素脂多糖(LPS),導致大鼠膿毒血癥轉化為膿毒癥模型及腹膜炎型膿毒癥。破壞、先誘發肺炎后進一步發展動物自身屏障型:如制造燒傷型膿毒癥模型、CLP模型。研究表明,CLP制備的大鼠膿毒癥模型和臨床更接近,且易于操作,易于復制,是目前應用最廣泛的模型〔12〕。UCP是存在于線粒體內膜上的一種質子轉運體,目前已發現5類UCP,其中UCP2是表達最廣泛的一種,在多種組織中呈高表達,如心、肺等〔13〕。UCP2在多種物質之間有一定的同源性,與其他UCP一樣,UCP2的功能主要通過質子漏功能驅散線粒體內膜與基質之間的質子電化學梯度,使質子回流基質與ATP合酶發生解耦聯。在膿毒癥或炎性實驗的模型中,已經發現在心肌、肝、骨骼肌等組織中UCP2的表達明顯上調〔14〕。同時研究表明,UCP2在調控炎性反應、限制氧化應激及維持線粒體生理功能方面具有重要作用,介導膿毒癥的病理生理機制〔15〕。本研究結果和上述研究一致。

膿毒癥一旦合并心肌損傷可加重疾病的演變過程,增加多臟器衰竭及死亡的風險。近年來一些臨床研究表明,膿毒癥患者有一半以上會發展成心肌損傷,且所導致的心功能不全與膿毒癥致死率明顯相關。細胞凋亡也稱成為程序性的細胞死亡,心肌細胞凋亡在膿毒癥心肌損傷中發揮重要作用,抑制心肌細胞凋亡有助于逆轉膿毒癥心肌損傷〔16〕。本研究結果顯示,過表達UCP2可抑制膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡,改善心肌組織病理學變化。研究表明,氧化應激是導致凋亡的機制之一。MDA是細胞膜上多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后產生的脂質過氧化產物,當MDA含量增高時表示體內氧化應激隨之增加。SOD屬于機體抗氧化酶,能保護細胞免受損傷。MDA和SOD結合多用于評價機體的氧化應激情況。本研究結果顯示,過表達UCP2能抑制膿毒癥大鼠體內MDA含量,增加SOD活性,通過調整心肌細胞抗氧化防御及活性氧之間的平衡狀態,從而抑制膿毒癥大鼠的心肌細胞凋亡。孟繁甦等〔17〕研究證實,預先給予血必凈注射液對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡具有保護作用,這可能與血必凈注射液能夠降低心肌細胞中MDA含量,增加SOD活性,對氧化應激損傷進行一定的改善,同時減少心肌細胞的凋亡。

PKR是一種雙鏈RNA蛋白酶,在膿毒癥肺損傷患者中PKR出現低表達。黃楊等〔18〕研究證實,姜黃素能夠提高膿毒癥感染急性肺損傷(ALI)大鼠免疫功能,降低炎癥表達,其機制可能是用過增加PKR蛋白表達來實現的。細胞焦亡是程序性細胞死亡方式之一,一般依賴致炎性Caspase,介導多種疾病,例如感染性疾病、自發性炎性疾病、自身免疫性疾病和相關癌癥等,同時伴隨炎性小體和 Caspase-11激活。研究發現,革蘭陰性菌的LPS是激活Caspase-11的重要模式分子,在正常機體內,Caspase-11在細胞中呈低表達,這說明細菌感染后,LPS 在引起Caspase-11的細胞焦亡中起到了關鍵作用〔19〕。本研究結果顯示,Caspase-11在膿毒癥大鼠中呈高表達,過表達UCP2對Caspase-11的表達可進行有效的抑制。劉雨濃等〔20〕研究證實,黃連解毒湯有效組分可降低細胞內LPS,進而抑制Caspase-11,降低Caspase-11介導的Caspase-1 依賴的細胞焦亡作用。

綜上所述,過表達UCP2可抑制膿毒癥腹腔感染大鼠心肌細胞凋亡,調控體內氧化應激平衡,同時對PKR/Caspase-11蛋白有一定的調控作用,增加PKR表達,抑制Caspase-11的表達。