CircCPA4調節miR-377-3p/GGA3軸對肺癌細胞增殖、凋亡和上皮間質轉化的影響

金曼 王彤輝 任小飛 李淼

數據顯示,肺癌死亡人數占癌癥死亡人數的20%,其死亡率在所有類型的腫瘤中排第一位[1]。因此,闡明肺癌進展的潛在機制,并確定肺癌的潛在生物標志物和治療靶點迫在眉睫。環狀RNA(circRNA)是一種具有內源性和保守性的非編碼RNA,通過反向剪接形成共價閉合的連續環,更穩定可以用作有效診斷和治療癌癥的生物標志物[2,3]。Tao等[4]發現,circCPA4敲低可以在體外抑制細胞集落形成、遷移、侵襲、細胞周期進程,并加速肺癌細胞的凋亡,且circCPA4缺乏可以抑制肺癌小鼠腫瘤生長。研究發現CircRNA-miRNA-mRNA 信號軸調節肺癌發展進程[5]。且Sun等[6]發現下調miR-377-3p顯著加速非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的體外生長和轉移以及體內腫瘤的生長,而上調GGA3促進NSCLC細胞增殖[7]。本研究主要探究CircCPA4對肺癌細胞增殖、凋亡以及EMT的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2020年8月至2022年10月在我院就診的20例肺癌患者肺癌組織及其相鄰正常組織樣本。組織樣品保存在-80℃冰箱。受試者均簽署書面知情同意書,本研究已獲得醫院倫理委員會的批準。人肺癌細胞A549購自廈門逸漠生物科技有限公司;人正常肺上皮細胞BEAS-2B購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;si-NC、si-CircCPA4、inhibitor NC、miR-377-3p inhibitor購自上海生工;CCK-8細胞增殖試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自無錫云萃生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自弗元(上海)生物科技有限公司;GGA3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自Abcam。

1.2 細胞培養及分組 (1)A549細胞接種于Dulbecco的改良DMEM培養基中,培養基含有10%胎牛血清,將A549細胞在37℃、含有5%CO2的細胞培養箱中培養。(2)待A549細胞生長至70%左右,根據轉染試劑盒將si-NC、si-CircCPA4、si-CircCPA4+inhibitor NC、si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor分別轉染至A549細胞,命名為si-NC組、si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組、si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor 組,另取未做任何處理的A549細胞記為NC組。轉染48 h后,用于后續實驗。

1.3 雙熒光素酶報告基因實驗檢測CircCPA4、miR-377-3p、GGA3關系 構建CPA4野生型質粒(CPA4-WT)和突變型質粒(CPA4-MUT),將CPA4-WT和CPA4-MUT分別與mimic NC或miR-377-3p mimic共轉染于A549細胞分別記為miR-NC+WT-CPA4組、miR-377-3p mimic+WT-CPA4組、miR-NC+MUT-CPA4組、miR-377-3p mimic+MUT-CPA4組;構建GGA3野生型質粒(GGA3-WT)和突變型質粒(GGA3-MUT),將GGA3-WT和GGA3-MUT分別與mimic NC或miR-377-3p mimic共轉染于A549細胞,分別記為miR-NC+WT-GGA3組、miR-377-3p mimic+WT-GGA3組、miR-NC+MUT-GGA3組、miR-377-3p mimic+MUT-GGA3組,48 h后評估A549細胞的熒光素酶活性變化。

1.4 qRT-PCR檢測CircCPA4、miR-377-3p表達 根據試劑盒說明書,使用Trizol試劑從肺癌組織和細胞中提取總RNA,通過反轉錄合成cDNA。將cDNA、引物、MIX混合置于qRT-PCR儀擴增。以GAPDH、U6為內參基因,用2-ΔΔCt方法計算CircCPA4、miR-377-3p的相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.5 Western blot檢測GGA3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及凋亡蛋白表達 使用RIPA裂解液從A549細胞中提取蛋白質,并通過BCA試劑盒檢查蛋白質濃度。使用SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉移到PVDF膜上。隨后,用5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗GGA3(1∶1 000)、E-cadherin(1∶2 000)、N-cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),4℃下孵育一夜,加入二抗常溫下繼續反應1 h。最后加入ECL試劑顯色,Image J目的條帶灰度值分析。

1.6 CCK-8法檢測A549細胞增殖情況 將轉染的細胞以5×103個細胞/孔的密度接種在96孔板上,隨后每孔加入10 μl CCK-8試劑在37℃下繼續孵育2 h,用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD450)值。

1.7 流式細胞術檢測A549細胞凋亡 細胞轉染處理后,消化并收獲細胞。然后用預冷的PBS洗滌細胞2次。去除PBS,將細胞重懸于100 μl緩沖液中。然后將細胞與5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色溶液在室溫下避光孵育。孵育10 min后,使用流式細胞儀分析凋亡情況。

1.8 Transwell試驗測定細胞遷移和侵襲 將基質膠預包被在Transwell上室用于侵襲測定,而不包被基質膠的上室用于遷移測定。上室加入5×104個/ml A549細胞,下室加入含有10% FBS的DMEM培養基,孵育48 h后,用棉簽除去濾膜上的細胞,然后將Transwell室中的殘留細胞用4%多聚甲醛在4℃下固定10 min,結晶紫在室溫下染色5 min,并在顯微鏡下隨機選擇5個區域計算細胞數。

2 結果

2.1 CircCPA4靶向調控miR-377-3p /GGA3軸 通過TargetScan網站發現CircCPA4與miR-377-3p ,miR-377-3p 與GGA3存在結合位點。與miR-NC+WT-CPA4組比較,miR-377-3p mimic+WT-CPA4組A549細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而miR-377-3p mimic+MUT-CPA4組A549細胞的熒光素酶活性較miR-NC+MUT-CPA4組無顯著改變(P>0.05);與miR-NC+WT-GGA3組比較,miR-377-3p mimic+WT-GGA3組A549細胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),miR-377-3p mimic+MUT-GGA3組較miR-NC+MUT-GGA3組A549細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1,表2、3。

圖1 TargetScan網站預測CircCPA4與miR-377-3p 、miR-377-3p 與GGA3的結合位點

表2 雙熒光素酶報告基因實驗驗證CircCPA4與miR-377-3p 的靶向關系 n=6,

表3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-377-3p與GGA3的靶向關系 n=6,

2.2 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3在組織和細胞中的表達 肺癌組織較相鄰正常組織CircCPA4、GGA3水平顯著升高(P<0.05),miR-377-3p顯著降低(P<0.05);與BEAS-2B細胞相比,A549細胞中CircCPA4、GGA3水平均顯著上調(P<0.05),miR-377-3p顯著下調(P<0.05)。見表4、5,圖2、3。

圖2 Western blot檢測肺癌組織及相鄰正常組織中GGA3蛋白表達

圖3 Western blot檢測細胞中GGA3蛋白水平

表4 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在組織中的表達 n=20,

表5 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在細胞中的表達 n=6,

2.3 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在A549細胞中的表達 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組CircCPA4、GGA3水平顯著下調(P<0.05),miR-377-3p表達量顯著上調(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組GGA3水平顯著上升(P<0.05),miR-377-3p表達量顯著下降(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 Western blot檢測A549細胞GGA3蛋白表達;A NC組;B si-NC組;C si-CircCPA4組;D si-CircCPA4+inhibitor NC組;E si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組

表6 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在A549細胞中的表達 n=6,

2.4 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p 對A549細胞增殖的影響 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組A549細胞OD450值顯著減小(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組OD450值顯著增加(P<0.05)。見表7。

表7 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p對A549細胞OD450值的影響 n=6,

2.5 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p 對A549細胞凋亡的影響 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組A549細胞凋亡率顯著上升(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組A549細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見表8,圖5。

圖5 流式細胞術檢測A549細胞凋亡

表8 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p 對A549細胞凋亡率的影響 n=6,%,

2.6 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p對A549細胞侵襲、遷移以及EMT相關蛋白的影響 si-CircCPA4組較NC組、si-NC組A549細胞遷移、侵襲細胞數量以及N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著下降(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著上升(P<0.05);si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組較si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組A549細胞遷移、侵襲細胞數量以及N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表9、10,圖6～8。

圖6 Transwell檢測A549細胞遷移(結晶紫染色×400)

圖7 Transwell檢測A549細胞侵襲(×400)

圖8 Western blot檢測細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達;A NC組;B si-NC組;C si-CircCPA4組;D si-CircCPA4+inhibitor NC組;E si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組

表9 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p 對A549細胞侵襲和遷移細胞數量的影響 n=6,個,

表10 沉默CircCPA4或下調miR-377-3p 對A549細胞中EMT相關蛋白表達的影響 n=6,

3 討論

近年來,circRNA由于其特殊的結構和廣泛的分布,被認為是人類癌癥中潛在的生物標志物[8]。CircHIPK3沉默有效抑制肺癌細胞的存活和增殖,顯著誘導細胞凋亡[9]。CircMAN2B2敲低顯著抑制了肺癌H1299和A549細胞的增殖和侵襲[10]。Hong等[11]發現Circ-CPA4調節NSCLC的細胞生長、干性、耐藥性和免疫逃逸。Tao等[4]也發現Circ-CPA4在肺癌中高表達,Circ-CPA4上調可以促進肺癌細胞的進展。本研究中,在肺癌組織和肺癌細胞A549中CircCPA4高表達。通過細胞凋亡有效消除癌細胞一直是臨床癌癥治療的主要手段[12]。在本研究中,沉默CircCPA4后A549細胞OD450值顯著下降,A549細胞凋亡率顯著升高,暗示CircCPA4下調可能通過抑制A549細胞增殖,促進A549細胞凋亡來抑制肺癌發展。EMT是一個重要的發育過程,也與疾病病理生理學有關,例如癌癥的遷移、侵襲和轉移[13]。EMT取決于細胞黏附分子表達的減少和緊密連接的喪失。研究表明,EMT的調節可能代表了一種針對NSCLC的新興治療方法[14]。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin是EMT常見標志物,有研究報道,上調N-cadherin、vimentin蛋白水平,下調E-cadherin蛋白水平可以促進肺癌EMT[15]。本研究中,CircCPA4沉默使A549遷移、侵襲細胞數量、N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著下降,E-cadherin蛋白水平顯著升高,表明CircCPA4下調可能通過抑制EMT進程,來抑制肺癌的進展。

通過生物信息學分析發現CircCPA4與miR-377-3p存在結合位點。miR-377-3p在肺癌中低表達已經被證實,例如Ke等[16]發現,下調miR-377-3p誘導肺部腫瘤發生。Hua等[17]也發現,下調miR-377-3p促進NSCLC的進展,且促進異種移植小鼠中肺癌腫瘤的生長。以上研究均表明miR-377-3p影響肺癌進展。本研究結果顯示,miR-377-3p在肺癌組織及細胞低表達,CircCPA4沉默促進miR-377-3p表達,而抑制miR-377-3p表達削弱了沉默CircCPA4抑制A549細胞惡性生物學行為的效果。提示沉默CircCPA4可能通過上調miR-377-3p發揮抑制肺癌發展的作用。

通過生物信息學分析發現miR-377-3p與GGA3存在結合位點。據報道,GGA3與癌細胞的遷移、增殖和凋亡有關[18]。研究發現,上調GGA3可以促進NSCLC的細胞增殖、侵襲,抑制其凋亡[7]。本研究結果與其一致,GGA3在肺癌組織和A549細胞高表達,且沉默CircCPA4降低了A549細胞中GGA3蛋白水平,而下調miR-377-3p則升高了GGA3蛋白水平,證實沉默CircCPA4可能通過上調miR-377-3p來抑制GGA3表達,進而抑制A549細胞增殖、EMT,促進A549細胞凋亡。雙熒光素酶報告基因實驗也證實CircCPA4靶向調控miR-377-3p/GGA3軸。

綜上所述,沉默CircCPA4可能通過上調miR-377-3p來抑制GGA3表達,進而抑制A549細胞增殖、EMT進程,促進A549細胞凋亡。